Investigação de transições estruturais e da reatividade sobre peróxidos de TSA1 (thiol specific antioxidant protein 1) de Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Thiol specific antioxidant (TSA) ou tiorredoxinas peroxidases (TPx) constituem um grupo de proteínas antioxidantes que vêm sendo bastante estudadas pela atuação na decomposição de diversos tipos de peróxidos, como peróxidos de lipídeos, peroxinitritos e peróxido de hidrogênio (H2O2). Assim como outras tiol oxirredutases, as TPxs são comuns na natureza; entretanto, diferentemente das demais, elas são encontradas nos mais diversos compartimentos celulares. Em Saccharomyces cerevisiae já foram identificadas cinco isoformas, sendo três encontradas no citoplasma (Tsa1, Tsa2 e Ahp1), uma na mitocôndria (Prx1) e uma no núcleo (nTPx). Dentre as Tpx desta levedura, Tsa1 e Tsa2 chamam a atenção, uma vez que apresentam grande semelhança quanto à estrutura primária (86% de identidade e 96% de similaridade), porém diferem consideravelmente no que se refere à quantidade de cópias na célula (Tsa1 ~378.000 moléculas; Tsa2 ~4.820) e quanto ao pKa da cisteína catalítica, o que provavelmente possa ser explicado pelas pequenas diferenças nas características estruturais intrínsecas das enzimas. A capacidade de decomposição de peróxidos pelas TPx está relacionada à presença em seus sítios ativos de um resíduo de cisteína de alta reatividade, denominado cisteína peroxidásica (CysP), envolvido diretamente na decomposição destes substratos. Adicionalmente, a grande maioria das Tpx possui uma segunda cisteína, denominada de cisteína de resolução (CysR), a qual durante o ciclo de oxidorredução forma um dissulfeto com CysP. A maior parte das TPx utiliza tiorredoxina (Trx) - uma proteína de baixo peso molecular com duas cisteínas vicinais - como substrato redutor durante o ciclo catalítico. Durante as reações de oxidorredução, as TPx necessitam efetuar uma mudança estrutural das a-hélices nas quais se encontram os resíduos de cisteínas reativas, alternando entre duas conformações: fully folded (FF), quando a proteína está na forma reduzida e a a-hélice na qual está localizada a CysP se encontra totalmente enovelada, e locally unfolded (LU), observada após a interação com o peróxido, que ativa o desenovelamento da a-hélice para a formação de dissulfeto entre as cisteínas. Recentemente demonstramos que os resíduos de aminoácidos E50 e R146 possuem papel essencial na transição dos estados FF e LU, uma vez que mutantes de Tsa1 de S. cerevisiae (Tsa1E50A e Tsa1R146QF) apresentam mudanças estruturais relevantes e perda da atividade peroxidásica frente à Trx. Este projeto de pesquisa tem por objetivo a investigação de mecanismos moleculares responsáveis por alterações estruturais e a transição dos estados FF e LU de Tsa1. Para tanto serão realizados experimentos de cristalização e a determinação da estrutura tridimensional de mutantes Tsa1E50A e Tsa1R146Q através da metodologia de cristalografia de raios-X. Também será efetuada a mutação Tsa1D141A e os efeitos desta serão avaliados através de ensaios in vitro de atividade enzimática, cromatografia de exclusão molecular e espectroscopia de dicroísmo circular. Adicionalmente, para se estudar as diferenças no pKa da cisteína peroxidásica e a reatividade em relação a peróxidos orgânicos e H2O2 de Tsa1 e Tsa2, serão feitas substituições dos aminoácidos Ile39, Thr44 e Pro143 de Tsa1 por resíduos que ocupam posição espacial correspondente em Tsa2. Em seguida, serão avaliados os efeitos estruturais e funcionais dessas mutações (Tsa1I39V, Tsa1T44S e Tsa1P143S) a fim de verificar quais delas são importantes na diferenciação de Tsa1 e Tsa2. Uma vez que as TPx de S. cerevisiae possuem representantes ortólogos em mamíferos - em especial com humanos - os resultados obtidos poderão contribuir para um melhor entendimento do funcionamento destas proteínas que estão relacionadas com doenças genéticas envolvendo agregação proteica e o crescimento celular desordenado, como Alzheimer e câncer. (AU)