Conectando aspectos estruturais e bioquímicos de peroxirredoxinas a processos de sinalização celular e controle de qualidade proteica

Resumo

Peróxido de hidrogênio e outros peróxidos estão envolvidos em sinalização celular e, portanto, seus níveis são regulados de forma bastante sofisticada. Dentre os vários sistemas celulares capazes de decompor peróxidos, destacam-se as 2-Cys peroxirredoxinas (2-Cys Prx) que são peroxidases que utilizam um resíduo de cisteína altamente reativo (cisteína peroxidásica - CysP) para reduzir eficientemente uma ampla variedade de hidroperóxidos. A alta reatividade associada à sua grande abundância são propriedades compatíveis com as evidências de que as 2-Cys Prx atuam como sensores de peróxidos em várias células, seja de forma direta ou indireta pela interação com proteínas sinalizadoras (como quinases e fatores de transcrição) ou pela oxidação de Tiorredoxina (Trx). De fato, as 2-Cys Prx estão envolvidas em sinalização celular, estando relacionadas em processos como câncer, neurodegeneração, interação patógeno-hospedeiro, entre outros. Todavia, os mecanismos subjacentes a esse fenômeno não estão totalmente elucidados, em parte porque aspectos bioquímicos, cinéticos e estruturais relacionados às 2-Cys Prxs são ainda pouco claros. Entre outros aspectos complicadores, 2-Cys Prx podem sofrer transições estruturais entre dímeros, decâmeros ou estruturas de alto peso molecular durante o ciclo catalítico, dependendo do estado redox da CysP entre outros fatores. Essa variação estrutural tem influência direta nos processos de sinalização redox e de agregação proteica (o qual está relacionado com diversas patologias). Temos contribuído para esclarecer alguns desses aspectos, tendo identificado o papel de resíduos específicos. No presente projeto, o objetivo principal é investigar o impacto de mutações nesses resíduos de 2-Cys Prx no contexto celular. Nesse sentido, pretendemos utilizar linhagens delta_tsa1, delta_tsa2, delta_tsa1/tsa2 entre outras linhagens de levedura (Tsa1 e Tsa2 são duas Prx 2-Cys citosólicas de Saccharomyces cerevisiae) expressando 2-Cys Prxs com mutações em resíduos avaliados previamente in vitro, avaliando a oligomerização, superoxidação da CysP, estado redox de tiorredoxinas, além de efeitos sobre crescimento celular, suscetibilidade a hidroperóxidos e envelhecimento dentre outros. Alternativamente, pode ser utilizada a técnica de CRISPR para a obtenção dos mutantes. Como objetivos complementares, serão realizadas análises bioquímicas visando obter as constantes de redução de Tsa1 e mutantes por Trx, bem como realizar análises de mutações equivalentes com as 2-Cys Prx citosólicas de humanos (Prx1 e Prx2). Por fim, pretendemos realizar análises estruturais por meio de diversas técnicas como SAXS, crio-eletromicroscopia, cromatografia de exclusão molecular, cristalografia de raio-X, de modo a ter um maior entendimento de como as mutações afetam a estrutura das 2-Cys Prx. (AU)