Busca de inibidores do sistema peroxirredoxina 2-Cys típicas de eucariotos: avaliação funcional e estrutural

Resumo

A produção maciça de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs) representam uma das principais linhas de defesas dos hospedeiros contra o ataque de micro-organismos patogênicos. Entretanto, no curso da evolução, os micro-organismos desenvolveram enzimas altamente eficientes capazes de decompor EROs e ERNs e neutralizar as defesas do hospedeiro, como as peroxirredoxinas (Prx), que se destacam por decompor uma grande variedade de hidroperóxidos com alta especificidade e eficiência (k = 10^6 - 10^8 M-1 s-1), utilizando uma cisteína altamente reativa denominada de cisteína peroxidásica e estarem distribuídas nos mais diversos ambientes celulares. Estas enzimas possuem variabilidade estrutural e funcional e podem ser divididas em três classes: Prx 1-Cys, 2-Cys típicas e 2-Cys atípicas. As Prx 2-Cys típicas são as mais abundantes nos organismos, contribuindo de forma decisiva para a manutenção da homeostase celular e são objeto deste estudo. Em fungos patogênicos, o estresse oxidativo/nitrosativo promovido por células de defesa e/ou pela ação de fungicidas, é utilizado para controlar a infecção no hospedeiro. Entretanto, em indivíduos imunocomprometidos, infecções invasivas e linhagens resistentes aos principais fungicidas, como a anfotericina B e azoles, representam um grave problema de saúde pública. Neste contexto, as Prx 2-Cys típicas de fungos patogênicos aparentam ser um alvo bastante importante para fungicidas, entretanto nenhum inibidor de Prx 2-Cys típicas foi caracterizada para estes organismos. Por outro lado, já foram descritos inibidores destas enzimas para mamíferos, dentre eles diterpenóides naturais como a Adenantina (Adn) e o JDA-202, que são capazes de inibir isoformas citosólicas 2-Cys típicas de humanos, levando a remissão de tumores e apresentando baixa toxicidade para células sadias. É importante ressaltar que os estudos que investigam inibidores de Prx 2-Cys típicas nunca atentaram para uma avaliação de forma comparativa com enzimas de outros organismos, onde há a possibilidade de uma mesma molécula poder ser aplicada para outras finalidades como o combate a organismos patogênicos. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a Adn é capaz de inibir as isoformas citosólicas 2-Cys típicas Tsa1 e Tsa2 de S. cerevisiae, um organismo modelo para estudos bioquímicos e genéticos. Investigações realizadas no âmbito do projeto aqui proposto revelaram que Tsa1 apresenta alta identidade com isoformas citosólicas de leveduras patogênicas dos gêneros Candida e Cryptococcus e em Rhodotorula mucilaginosa, revelando que esta levedura é um bom modelo para estudo destes organismos. Os objetivos deste projeto residem em buscar compostos naturais da biota costeira de São Paulo com atividade inibitória sobre Prx 2-Cys típicas de fungos, utilizando como modelo Tsa1 de S. cerevisiae de forma comparativa com Prx2, a isoforma mais abundante de Prx 2-Cys típica de humanos. Também será utilizada esta levedura para ensaios in vivo do potencial fungicida dos compostos identificados como inibidores de Tsa1 e também de inibidores + fungicidas largamente utilizados em tratamentos clínicos. Adicionalmente, será avaliado a geração de radical hidroxila em células submetidas aos tratamentos supracitados. O projeto já se encontra iniciado e em conjunto com o grupo de pesquisa do Prof. Dr. João H. G. Lago da UFABC foram identificados, selecionados e purificados compostos naturais oriundos da flora brasileira que possuem caraterísticas potenciais para se comportar como inibidores de Prx 2-Cys típicas. Também já foram estabelecidas as condições de expressão e purificação de proteínas alvo do projeto e ensaios preliminares de inibição da atividade peroxidásica levaram a identificação de um composto (C3) que apresentou potente capacidade inibitória sobre Tsa1 de levedura (45.5% ± 5.7%) e moderada toxicidade sobre Prx2 de humanos (10.3 ± 5.8%). Ensaios adicionais para a confirmação dos resultados por outras metodologias estão em andamento. (AU)