Asparaginase1 de Saccharomyces cerevisiae: Investigação dos efeitos funcionais e estruturais da cauda N-terminal

Resumo

O tratamento da leucemia linfoide aguda (LLA) é comumente realizado pelo uso de asparaginases bacterianas (ASNase) como a de Escherichia coli (EcA) nativa ou conjugada com polietilenoglicol (PEG-EcA) ou de Erwinia chrysanthemi (ErA). Estas enzimas são homotetraméricas e apresentam elevada massa molecular (~140 kDa). Sua atividade antitumoral baseia-se na incapacidade de células leucêmicas de produzir o aminoácido l-asparagina (Asn) em níveis adequados, necessitando utilizar o Asn da corrente sanguínea. As ASNases catalisam a reação de hidrólise de Asn em aspartato (Asp) e amônia (NH3), depletando a fonte de Asn para as células neoplásicas ocasionando apoptose. Adicionalmente, as ASNases possuem atividade secundária de glutaminase (GLNase), hidrolisando o aminoácido glutamina (Gln) em ácido glutâmico (Glu) e NH3, atividade relacionada com uma série de efeitos colaterais, incluindo respostas imunológicas e reações alérgicas que podem levar a choques anafiláticos. Em alguns casos, a própria EcA pode causar efeitos imunológicos, o que pode ser sanado pela introdução de moléculas de PEG no fármaco. Entretanto, tal alteração pode ocasionar reação cruzada pela ação dos anticorpos anti-EcA, e a substituição por ErA representa uma alternativa. No entanto, parte dos pacientes ainda apresentam respostas imunológicas. Desta forma, a busca de novas ASNases apresenta grande importância na obtenção de enzimas alternativas e/ou com menores efeitos adversos. Cabe ressaltar que no Brasil somente a EcA, nativa e peguilada possuem o certificado da ANVISA o que pode prejudicar o tratamento de pacientes com LLA. Recentemente, nosso grupo de pesquisa caracterizou uma nova ASNase oriunda de Saccharomyces cerevisiae (Asp1), com elevada afinidade por Asn e alta citotoxicidade para células tumorais de LLA. No entanto, quando expressa em condições oxidantes, experimentos de cromatografia de exclusão molecular revelaram uma enzima monomérica, com aproximadamente ¼ da massa molecular quando comparada com as enzimas bacterianas, uma característica bastante importante, pois o reduzido tamanho tende a diminuir os efeitos imunogênicos. A análise da sequência de aminoácidos de Asp1 revelou a presença de uma extensão N-terminal de aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos ausente nas enzimas EcA e ErA, e observada apenas em um grupo muito pequeno de leveduras (< 10 espécies). De fato, esta porção da proteína pode estar relacionada com sua atividade como monômero e também estar relacionado para qual compartimento celular a enzima deve migrar em S. cerevisiae ou mesmo ser exportada, como o observado para a isoforma Asp3. Neste contexto, a expressão recombinante em bactérias em condições oxidantes, que resulta na formação de monômero com alta atividade, pode reproduzir uma enzima com característica similar à proteína nativa. Contudo, até o presente momento nenhum trabalho atentou para investigar a função desta porção proteica de Asp1. Este projeto tem como objetivo avaliar se existe função sinalizadora desta porção e também avaliará a deleção da cauda N-terminal sobre a atividade e estrutura da enzima Asp1, utilizando construções para a proteína truncada (Asp1”NT) e a selvagem fusionada a eGFP para determinar localização celular. Para tanto serão utilizadas metodologias envolvendo biologia molecular (construção Asp1”NT e Asp1wt- eGFP), análises bioquímicas (testes de atividade de ASNase e GLNase), biofísicas (dicroísmo circular - estrutura secundaria; cromatografia de exclusão molecular - estrutura terciária/quaternária; deslocamento térmico - estabilidade) e celulares (microscopia de fluorescência - determinação de localização celular). Acreditamos que os resultados obtidos neste projeto auxiliarão significativamente na caracterização da enzima Asp1, visando um potencial biofármaco alternativo para a LLA.