AhpC de Salmonella typhimurium e de Staphylococcus aureus: Investigação do potencial inibitório de Adenantina sobre peroxirredoxinas bacterianas

Resumo

A crescente incidência de infecções resistentes à ação de diferentes classes de antibióticos juntamente com o declínio da descoberta de novas classes eficientes no combate aos patógenos, representa uma ameaça a saúde pública global. Neste contexto, existe uma necessidade de expansão do entendimento dos mecanismos de defesa microbiana com finalidade de potencializar a inativação e morte de patógenos por estes agentes bem como buscar novas classes que possuam toxicidade seletiva para os patógenos. Estudos recentes demonstraram que diferentes classes de antibióticos geram elevados níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) que contribuem para a morte celular bacteriana. Esta noção serviu para refinar os aspectos dos modelos propostos em muitos laboratórios na investigação destas moléculas e da permanência da infecção causada por espécies bacterianas. As Alquil hidroperóxido redutase C (AhpCs) pertencem a um grupo de peroxidases denominadas de peroxirredoxinas 2-Cys típicas (Prx 2-Cys típicas), que possuem como características a capacidade de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos utilizando um resíduo de cisteína denominado de cisteína peroxidásica (CP), o qual faz parte da tríade catalítica destas enzimas representada por uma arginina (Arg) e uma treonina (Thr) ou uma serina (Ser). Os resíduos de CP e Arg, são estritamente conservados entre todas as Prx 2-Cys típicas, no entanto o resíduo de Thr pode ser substituído por uma Ser, algo considerado redundante até pouco tempo atrás. Recentemente, demonstramos que Thr ou Ser na tríade catalítica confere diferenças funcionais e estruturais entre as enzimas (Tairum et al., 2016). As Prx 2-Cys típicas de bactérias, são alvos de diversas pesquisa por conferirem resistência significante ao sistema imune do hospedeiro, e resultados iniciais do nosso grupo de pesquisa revelou que bactérias do gênero Staphylococcus, que possuem Ser como parte da tríade catalítica, apresentaram morte celular mais acentuada na presença do inibidor de Prx 2-Cys Adenantina (Adn) do que as linhagens de Eschericchia coli, que possuem Thr. Este projeto tem por objetivo o aprofundamento dos estudos da inibição de AhpCs de bactérias contendo Thr ou Ser na tríade catalítica utilizando Salmonella typhimurium (Thr) e Staphylococcus aureus (Ser) por Adn, causadoras de uma ampla gama de infecções graves em mamíferos. Para tanto os genes de AhpC de S. typhimurium (StAhpC) e S. aureus (SaAhpC) serão clonados e as proteínas recombinantes contendo cauda de histidinas (6 × His) serão expressas em sistemas bacterianos para purificação por IMAC. Para verificar a influência da substituição de Thr ’ Ser, serão efetuadas mutações sítio dirigidas para obtenção de enzimas carreando substituições recíprocas destes aminoácidos (StAhpCT44S SaAhpCS46T). Para se avaliar os efeitos de Adn sobre a atividade das AhpCs serão realizados ensaios de atividade peroxidásica (oxidação do DTT e FOX). Os efeitos da ligação desta molécula sobre a estrutura da proteína serão realizados procedimentos envolvendo cromatografia de exclusão molecular (SEC), espectroscopia de dicroísmo circular (CD) e ensaios em SDS PAGE não redutor. O projeto já se encontra em andamento e já foi estabelecido as condições de expressão e purificação de SaAhpC sendo possível obter 10mg/L de cultura de células, bem como iniciar os procedimentos para obtenção de SaAhpCT44S.