Efeitos compostos naturais sobre a atividade peroxidásica de AhpCs e sobrevivência de bactérias patogênicas

Resumo

Estudos recentes indicam que a resistência de bactérias aos antibacterianos pode estar diretamente relacionada ao estresse oxidativo, uma vez que antibacterianos de classes distintas possuem a capacidade comum de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs), que causam danos às macromoléculas, em especial ao DNA, acentuando as taxas de mutação o que pode contribuir para o aparecimento de linhagens super-resistentes. EROs também são produzidas por células imunes de hospedeiros para combater patógenos e estudos sugerem que a inibição de enzimas antioxidantes de patógenos é bastante deletéria para os patógenos. Bactérias possuem diversas enzimas antioxidantes capazes de decompor EROs, com destaque para as peroxirredoxinas 2-Cys típicas, denominadas em bactérias de AhpC, as quais são extremamente abundantes e apresentam alta reatividade frente a hidroperóxidos. As Prx 2-Cys são capazes de decompor os substratos utilizando um resíduo de cisteína (Cys peroxidásica - CP) que, após decompor o peróxido, forma um dissulfeto com um segundo resíduo de cisteína (Cys de resolução - CR). A alta reatividade de CP é alcançada por interações com os resíduos de Thr (em alguns casos Ser) e Arg, denominados de tríade catalítica (TC), absolutamente conservados entre as Prx 2-Cys. Recentemente, demonstramos que a substituição de Thr por Ser na TC leva a alterações funcionais e estruturais dessas proteínas, e que existe sobretudo em bactérias. Eucariotos também possuem Prx 2-Cys típicas, entretanto o ambiente do sítio ativo é significativamente diferente das AhpCs, pois em eucariotos as Prx 2-Cys típicas possuem uma cauda C-terminal que se projeta para o interior do sítio ativo. Acreditamos que estas duas características colocam AhpCs alvos de quimioterápicos capazes de inibir diferencialmente AhpCs bacterianas e do hospedeiro. Apesar de terem sido descritos inibidores de Prx 2-Cys de mamíferos, nenhum havia sido caracterizado para a isoforma AhpC de bactérias. É importante salientar que todos os inibidores descritos para Prx 2-Cys possuem em comum um extenso esqueleto hidrofóbico, e que alguns deles efetuam a inibição da Prx se ligando as cisteínas catalíticas através de um sistema carbonílico alfa, beta - insaturado. Recentemente, nosso grupo de pesquisa demonstrou que um composto natural (Adenantina-Adn) inicialmente identificado para proteínas de humanos é capaz de inibir eficientemente AhpC. Em seguida, buscamos por compostos similares a Adn de moléculas isoladas da flora brasileira e identificamos uma lactona sesquiterpênica (de CN3-LS) como inibidor de AhpCs bacterianas contendo Thr (IC50 = 0.553 ± 0.061mM) ou Ser (IC50 = 0.460 ± 0.025 mM) na TC. O composto apresentou citotoxicidade para bactérias Gram + (MIC50 ~ 100-350mM), mas não para Gram -, entretanto a citotoxicidade não foi avaliada em conjunto com células imunes. Os objetivos deste trabalho residem na expressão e purificação de AhpC de Pseudomonas aeruginosa (bactéria Gram - que contém Thr como parte da TC) e Staphylococcus epidermidis (bactéria Gram + com Ser na TC) e avaliar a capacidade inibitória de compostos naturais oriundos da biota do Brasil, que apresentem características similares aos compostos já descritos, visando a identificação de inibidores de AhpCs bacterianas. Para tanto, serão realizados ensaios bioquímicos para a determinação da inibição de atividade e determinação de IC50, análises computacionais, ensaios de citotoxicidade de compostos identificados sobre linhagens de bactérias isoladas, compostos + antibacterianos (canamicina, ciprofloxacino ou polimixina nonapeptideo) Este projeto já se encontra iniciado e até o momento foram testados compostos de quatro classes químicas diferentes, sendo que um deles, o CN ABP1, foi capaz de inibir a AhpC de P. aerugisona. (AU)