Investigação das interações moleculares entre AhpC de Staphylococcus epidermidis com hidroperóxidos orgânicos e inibidores

Resumo

Espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) são produzidas tanto pelo repertório de defesa do sistema imunológico dos hospedeiros para o combate a patógenos, quanto pela administração de antibióticos. Entre as EROs, os hidroperóxidos orgânicos (OHPs), incluindo os hidroperóxidos de lipídeos, representam potentes agentes microbicidas. As peroxirredoxinas 2-Cys (Prx 2-Cys) representam uma importante linha de defesa capazes de decompor uma grande variedade de substratos incluindo OHPs. Em bactérias, as Prx 2-Cys recebem o nome de alquil hidroperóxido redutase C (AhpC) e trabalhos apontam sua importância para a infecção e manutenção no hospedeiro. AhpCs utilizam um resíduo de cisteína reativa (cisteína peroxidásica, CP) para decompor os substratos, e a alta reatividade de CP é alcançada por interações com os aminoácidos Thr, em alguns substituído por Ser, e Arg, que formam a tríade catalítica (TC). Apesar da substituição de Thr por Ser ter sido considerada redundante, demonstramos que esta substituição leva a diferenças funcionais e estruturais de Prx 2-Cys, sendo comum em bactérias, mas quase inexistente em eucariotos. Outra diferença reside em um prolongamento C-terminal que se projeta no sítio ativo e ocorre quase que exclusivamente em isoformas de eucariotos. Neste contexto, é razoável supor que estas diferenças do microambiente do sítio ativo possam levar a diferenças na interação com substratos e inibidores. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que um composto natural (Adenantina, Adn), inicialmente identificado como inibidor das Prx1 e 2 de humanos, pode inibir com maior eficiência a AhpC de Escherichia coli apresentando IC50 = 0.481 ± 0.024 ¼M, entre 4-30 x menor que os determinados para as Prx1 e Prx2 de humanos, o que gerou uma solicitação de propriedade intelectual que foi recentemente submetida ao INPI (BR10 20200162454). Também identificamos dois compostos naturais oriundos da biota de São Paulo denominados de CN-LS1 e CN-AB1, e o IC50 para CN-LS1 foi determinado como 0.46 ± 0.025 ¼M. É importante ressaltar que estes três compostos apresentam como característica em comum um extenso esqueleto hidrofóbico, que remetem a peróxidos orgânicos, e um sistema carbonílico ±, ²-insaturado capaz de estabelecer uma adição de Michael com as cisteínas das AhpC. Entretanto, as interações moleculares entre AhpC com substratos biológicos, como hidroperóxidos orgânicos, ou inibidores ainda não foram investigadas. Este projeto tem como objetivo um maior entendimento da interação de AhpCs com ligantes como inibidores e hidroperóxidos orgânicos utilizando AhpC de Staphylococcus epidermidis (SeAhpC), a qual possui Ser na TC, como modelo para os estudos, em razão da importância médica de infecções ocasionadas por esta bactéria e a ausência de estudos de SeAhpC na literatura. Para tanto, serão executados procedimentos de bioinformática para a construção de um modelo teórico estrutural e realização de dockings com ligantes como hidroperóxidos orgânicos sintéticos, derivados de lipídeos e bases nitrogenadas e os inibidores identificados por nosso grupo de pesquisa (Adn, CN-LS1 e CN-AB1). Também serão efetuadas abordagens envolvendo biologia molecular e bioquímica (expressão heteróloga, parâmetros de atividade enzimática e determinação de inativação dose dependente) para avaliar a atividade da enzima recombinante frente a hidroperóxidos orgânicos e dos inibidores supracitados. Este projeto já foi iniciado e até o momento foi possível estabelecer as condições de expressão e purificação de SeAhpC com elevado rendimento (~280 ¼M/250 mL de cultura) e pureza (> 95%), e padronizado o ensaio acoplado de oxidação de NADPH para avaliação da atividade. Também foi construído um modelo estrutural de SeAhpC e efetuadas análises de interações moleculares entre AhpC e CN-LS1. Os resultados esperados neste projeto devem favorecer um maior entendimento de interações moleculares entre AhpCs e ligantes, como substratos biológicos e inibidores.