Construção e aplicação de dispositivos analíticos à base de papel na detecção de biomarcadores para diagnóstico clínico

Autor(es)

Glauco Pilon dos Santos

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Química
• Data de defesa: 2017-07-26

Membros da banca

Lauro Tatsuo Kubota; João Marcos Madurro; Hideko Yamanaka; Celso Aparecido Bertran; Cátia Ornelas

• Orientador: Scott W Phillips; Lauro Tatsuo Kubota

Resumo

A crescente demanda por dispositivos de diagnóstico rápidos, altamente sensíveis e de baixo custo tem estimulado esforços para a geração de sistemas analíticos simplificados, capazes de serem aplicados em campo. Este trabalho científico envolveu o estudo de diferentes abordagens para possibilitar a detecção qualitativa e quantitativa de biomarcadores para diagnóstico clínico em plataformas à base de papel. A primeira estratégia consistiu no entendimento dos princípios de funcionamento do dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral, permitindo avaliar as etapas críticas e consequentemente proporcionar as condições experimentais mais adequadas para o diagnóstico precoce da malária causada por Plasmodium falciparum, pela identificação do biomarcador HRP2. O melhor desempenho do dispositivo foi atingido por meio da utilização de 0,05 µg (1 µL / 50 µg mL-1) do anticorpo de captura e incubação por 5 minutos para sua adsorção; bloqueio da nitrocelulose com BSA 1,5% (m/v) contendo 0,1% do surfactante Tween-20 (v/v) por imersão e incubação por 10 minutos; 0,04 µg (20 µL/ 2 µg mL-1) de anticorpo de detecção conjugado com a enzima peroxidase; lavagem com solução tampão Tris-HCl 0,01 mol L-1 pH 7,4 contendo 0,15 mol L-1 de NaCl e 0,1% de Tween 20 (v/v); adição de 5 µL do substrato cromogênico TMB e realização da leitura no intervalo de 5-20 minutos após esta adição. O sistema com detecção colorimétrica apresentou um limite de detecção visual de 5 ng mL-1 (135 pmol L-1), cujo valor deve ser suficiente para identificar a contaminação pela malária no primeiro dia do aparecimento dos sintomas. A plataforma desenvolvida foi então aplicada para amostras de sangue de pacientes infectados pela doença, demonstrando eficiência na discriminação qualitativa de um resultado positivo e negativo e a geração de resultados confiáveis. Em outro estudo, com o intuito de proporcionar uma segunda geração do dispositivo, foi construído um sistema de detecção em 3D à base de papel capaz de ser acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral. Este sistema possibilita o diagnóstico de maneira quantitativa, automatizada e com amplificação de sinal por meio da incorporação de um novo material polimérico da classe dos poli(benzil éteres) que responde seletivamente a peróxido de hidrogênio, além de necessitar apenas da visualização de cor e de um cronômetro para a obtenção dos dados e posterior análise dos resultados. A delimitação das barreiras hidrofóbicas no papel foi realizada por meio de impressão à cera e foram avaliados os processos de orientação e tipo de papel a ser empregado na camada contendo o polímero. O processo de deposição do material na superfície do papel demonstrou uma maior repetibilidade quando realizada de forma automática por meio de um robô de manuseamento de líquidos. A condição de maior sensibilidade para o sistema de detecção em 3D foi atingida empregando uma concentração de polímero de 4,0 mg mL-1 com a obtenção de um limite de detecção de 0,02 mmol L-1 de peróxido de hidrogênio. Este sistema foi então acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral e utilizado em estudos iniciais na detecção da isoenzima MB da creatina quinase, um dos biomarcadores indicado para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio (AU)

• Processo FAPESP: 13/09171-2 - Construção e aplicação de dispositivo analítico à base de papel para o diagnóstico da malária causada por Plasmodium falciparum
• Beneficiário: Glauco Pilon dos Santos
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado