Caracterização da Hsp90 de Aedes aegypti e seus interatores SGT e complexo R2TP

Autor(es)

Natália Galdi Quel

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2019-08-29

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Juliana Ferreira de Oliveira; Juliana Helena Costa Smetana; Shaker Chuck Farah; Claudio Chrysostomo Werneck

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

A manutenção da proteostase é realizada por um sistema de controle de qualidade de proteínas, composto pelas chaperonas moleculares e pelo proteossoma. Entre essas chaperonas, Hsp90 é essencial para a proliferação celular, participando de processos como o enovelamento de proteínas-cliente e a regulação de proteínas envolvidas em sinalização celular. A atividade da Hsp90 é modulada pelas co-chaperonas, que influenciam no ciclo de ATPase e garantem especificidade. Um conjunto de co-chaperonas da Hsp90 possuem um ou mais domínios TPR (tetratricopeptide repeat), os quais interagem com o motivo MEEVD no C-terminal da Hsp90. Entre as interatoras de Hsp90, neste trabalho foram caracterizadas estrutural e funcionalmente a SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), que participa da translocação de proteínas ancoradas em membranas, e o complexo R2TP (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), o qual está envolvido na montagem e estabilização de complexos que participam de vários processos biológicos essenciais para a célula e interage com a Hsp90 através da subunidade Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – ambos de Aedes aegypti. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas com alto grau de pureza. Foram avaliados a estrutura secundária, estabilidade térmica e os parâmetros hidrodinâmicos das proteínas. Hsp90, SGT e Rvb1/Rvb2 foram também analisadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Finalmente, foram realizados experimentos de caracterização funcional e de interação entre as proteínas. A Hsp90 de Aedes aegypti apresentou atividade ATPásica com eficiência catalítica de 5,51 x 10-4 min-1 µM-1, condizente com suas ortólogas. Além disso, manteve um estado conformacional aberto durante todo o ciclo de ATPase, semelhante à Hsp90 humana e diferindo das Hsp90 de E. coli e levedura. Ainda, mostramos pela primeira vez que Hsp90 tem sua expressão aumentada em células de Aedes albopictus expostas a choque térmico, condizente com uma proteína requerida em situações de estresse. A SGT de Aedes aegypti mostrou ser uma proteína dimérica, não esférica e semelhante à SGT humana, mas diferente das SGTs de Leishmania braziliensis e de levedura. Interessantemente, demonstramos que mesmo na ausência da região C-terminal, a SGT de Aedes aegypti mantém uma estrutura globular, diferentemente do sugerido para a SGT humana. Finalmente, para as proteínas componentes do complexo R2TP, observamos que as Rvbs compõem um heterododecâmero; RPAP3 mostrou-se majoritariamente monomérica, e Pih1D1 mostrou equilíbrio concentração-dependente entre monômero e dímero. Interessantemente, Pih1D1 apresentou-se estável, diferindo de suas ortólogas. Ainda, avançamos na reconstituição do complexo R2TP in vitro. A caracterização dessas proteínas (Hsp90, SGT e complexo R2TP) de Aedes aegypti é importante pois pode contribuir para o entendimento do sistema de controle de qualidade de proteínas neste organismo, vetor de doenças tão importantes no contexto nacional (AU)

• Processo FAPESP: 14/25967-4 - Caracterização do papel de domínios ATPase e das co-chaperonas Hsp40 e hop humanas nos mecanismos celulares de termotolerância e supressão de agregação proteica
• Beneficiário: Natália Galdi Quel
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado