Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Xanthomonas citri subsp. citri: identificação de proteínas secretadas, mecanismos de recrutamento e regulação

Autor(es)

Lucas de Moraes Ceseti

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2023-02-03

Membros da banca

Cristina Elisa Alvarez Martinez; Adriano Cappellazzo Coelho; Danilo Ciccone Miguel; Maxuel de Oliveira Andrade; José Freire da Silva Neto

• Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez

Resumo

Sistemas de Secreção do tipo VI (T6SS) são maquinarias celulares empregadas por bactérias para translocar efetores diretamente para células procarióticas ou eucarióticas, intercedendo em conflitos biológicos ou promovendo virulência. O fitopatógeno Xanthomonas citri subsp. citri utiliza seu T6SS para resistir a predação por Dictyostelium discoideum, uma ameba de solo que se alimenta de bactérias no ambiente. Entretanto, o papel desempenhado pelo T6SS e os efetores que medeiam este mecanismo de sobrevivência ainda precisam ser esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi identificar condições que promovem a expressão e ativação do T6SS e identificar proteínas efetoras secretadas. Os resultados obtidos demonstraram um aumento na transcrição dos genes do T6SS após 9 h de co-incubação com D. discoideum e durante o cultivo da bactéria na superfície de folhas da planta-hospedeira Citrus sinensis. Para identificar proteínas secretadas via T6SS, a expressão e secreção do componente majoritário do tubo do T6SS, Hcp, foi monitorada em amostras de proteínas celulares e de sobrenadante de culturas. A superexpressão do regulador transcricional do T6SS, TagK, foi a única condição encontrada que promoveu aumento detectável nos níveis intracelulares de Hcp. Desta forma, a atividade do T6SS foi analisada em linhagens mutantes nos reguladores pós-transcricionais da atividade do T6SS, PppA e TagF, contendo vetor para a superexpressão de TagK. A secreção de Hcp não foi detectada nos sobrenadantes de culturas destas linhagens, sugerindo a ocorrência de outros níveis de regulação da atividade do T6SS. Diante da dificuldade em detectar atividade do T6SS, outras estratégias para identificação de efetores do sistema foram utilizadas. Assim, foi realizada a caracterização de genes corregulados com o T6SS e que codificam proteínas contendo domínios que sugerem possível função efetora. Para avaliar seus potenciais efeitos citotóxicos, os genes candidatos foram expressos ectopicamente em Saccharomyces cerevisiae e D. discoideum. A expressão de Xac4139 inibiu o crescimento da levedura e causou morte das amebas, enquanto Xac4125 e Xac4123 não exerceram efeito negativo sobre o crescimento de S. cerevisiae. Curiosamente, Xac4125 apresentou uma clara associação com os núcleos da ameba. Através de ensaios de co-purificação, foi demonstrado que Xac4125 e Xac4123 interagem entre si e, isoladamente, com o componente estrutural do T6SS, VgrG. Foi verificado também que estes dois candidatos são essenciais para garantir o fenótipo de resistência de X. citri à ameba. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para uma compreensão mais profunda do papel do T6SS na biologia deste importante fitopatógeno (AU)

• Processo FAPESP: 17/02318-9 - Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Xanthomonas citri subsp. citri: identificação de proteínas secretadas, mecanismos de recrutamento e regulação do sistema
• Beneficiário: Lucas de Moraes Ceseti
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto