Efeito na ativação de células T e NK modificadas com GXMR-CAR contendo distintos domínios de reconhecimento para Cryptococcus spp.

Autor(es)

Michele Procópio Machado

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2023-03-06

Membros da banca

Thiago Aparecido da Silva; Virgínia Picanço e Castro

• Orientador: Thiago Aparecido da Silva

Resumo

As infecções fúngicas invasivas representam um grave problema de saúde pública afetando mais de um bilhão de pessoas em todo o mundo, e entre os principais fungos causadores dessas doenças se destacam o Cryptococcus gattii e C. neoformans por acometerem indivíduos imunocompetentes e imunocomprometidos, respectivamente. A taxa de mortalidade anual está estimada em 625.000 óbitos decorrentes da criptococose. Cryptococcus spp. apresenta diversos fatores de virulência que medeiam a subversão da resposta imunitária do hospedeiro, fato que está associado a uma reduzida atividade microbicida de células fagocítica e a um comprometimento da diferenciação de células T em perfis efetores contra a criptococose. A cápsula polissacarídica é o principal fator de virulência de Cryptococcus spp., sendo composto majoritariamente por GXM (glucuronoxilomanana) que mascara componentes da parede celular fúngica passíveis de reconhecimento por células da imunidade. A terapia com antifúngico para o tratamento da criptococose leva a efeitos colaterais adversos ao hospedeiro e também ao aumento da resistência por Cryptococcus spp. aos antifúngicos. Com isso, imunoterapias têm sido propostas no tratamento da criptococose, e uso da terapia celular através de células T ou NK modificadas com receptor antigênico quimérico (CAR) é uma estratégia terapêutica promissora contra a criptococose. Estudos prévios demonstraram que o redirecionamento de células T expressando um CAR, contendo um domínio de reconhecimento específico para o GXM de Cryptococcus spp., foi capaz de reduzir a progressão da criptococose. Dessa forma, o presente trabalho investigou o efeito de distintos GXMR-CAR contendo diferentes scFv (domínio variável de cadeia única), oriundos dos clones 2H1 e 18B7 de anticorpos monoclonais (mAb) específicos para GXM, como constituintes da região de reconhecimento do antígeno de GXMR-CAR. Os vetores lentivirais dos construtos gerados 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR compartilham as sequências codificadoras para a região hinge/transmembrana (molécula de CD8) e a porção intracelular composta da molécula coestimulátoria CD137 (4-1BB) acoplado ao CD3ζ. Os plasmídeos de 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR foram co-transfectados com pMD2 e pPAX2 em células HEK-293T para a produção de partículas lentivirais visando a modificação de células Jurkat e NK-92. As células Jurkat modificadas com 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR reconheceram GXM solúvel de C. gattii (R265) e C. neoformans (H99), e essas células modificadas após a incubação com GXM solúvel ou leveduras de C. gattii ou C. neoformans produziram níveis elevados de IL-2. Além disso, células Jurkat expressando 18B7-GXMR-CAR ou 2H1-GXMR-CAR apresentaram sinalização tônica e de forma mais pronunciada após a expressão de 18B7- GXMR-CAR, e a ativação celular mediada pelos construtos de GXMR-CAR na presença ou ausência do alvo foi drasticamente mitigada após a incubação com Dasatinibe, um inibidor farmacológico de proteínas quinases da família Src. Os diferentes níveis de sinalização tônica desencadeado por 18B7-GXMR-CAR apresentaram forte relação com a oligomerização do scFv de GXMR-CAR na superfície celular, como constatado na microscopia de fluorescência uma elevada clusterização de 18B7-GXMR-CAR e uma distribuição mais homogênea de 2H1- GXMR-CAR. Os construtos de GXMR-CAR também mediaram a ativação de células T modificadas após co-cultivo com isolados clínicos de C. neoformans ou C. gattii e, além disso, as células modificadas produzirem elevados níveis de IL-2 após a incubação com soro de paciente com criptococose. Os construtos 18B7-GXMR-CAR e 2H1-GXMR-CAR foram expressos em células NK-92 para investigar a capacidade de mediar um efeito fungicida e fungistático sobre leveduras de C. neoformans ou C. gattii, porém não foi observado uma redução do crescimento do fungo na presença das células NK-92 modificadas. Por outro lado, a expressão dos construtos de GXMR-CAR induziu uma produção significativa de IFN-γ pelas células NK-92 modificadas mesmo na ausência e presença de Cryptococcus spp., e o construto 2H1-GXMR-CAR se destacou como maior indutor da liberação de IFN-γ. Os mecanismos envolvidos na ausência de atividade fungicida de células NK-92 modificadas com GXMR-CAR sobre o Cryptococcus spp. estão sendo investigados, e os indícios direcionam para uma baixa liberação de grânulos de perforina pelas células NK-92 modificadas a partir do domínio de transdução de sinal adotado nos construtos de GXMR-CAR avaliados. Portanto, concluímos que ambos os scFv de 2H1 e 18B7, pertencentes ao GXMR-CAR, promovem um nível de ativação próximo nos diferentes tipos celulares modificados e incubados com o ligante, e indícios contundentes demonstram que a distinção na oligomerização do GXMR-CAR causada pelos diferentes scFv reflete na intensidade da sinalização tônica mediada por GXMR-CAR. (AU)

• Processo FAPESP: 20/11307-3 - Impacto de distintos scFv em GXMR-CAR expresso por linfócitos T na etapa de ativação celular frente a Cryptococcus spp
• Beneficiário: Michele Procópio Machado
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado