Estudos sobre o papel das vesículas da matriz na mineralização óssea: observações de micro à nanoescala

Autor(es)

Marcos Antonio Eufrásio Cruz

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2023-04-19

Membros da banca

Ana Paula Ramos; Márcio Mateus Beloti; Celso Aparecido Bertran; Willian Fernando Zambuzzi

• Orientador: Ana Paula Ramos; Pietro Ciancaglini

Resumo

A biomineralização óssea é um processo complexo que envolve a deposição de cristais de fosfato de cálcio em fibrilas de colágeno da matriz extracelular (MEC). Embora tenha sido proposto que as vesículas da matriz (VMs) atuem nesse processo, os mecanismos envolvidos ainda são pouco entendidos. Esta tese buscou examinar a interação entre as VMs e a formação mineral por meio de observações em três níveis: vesículas individuais, em um modelo mimético de membrana, e em cultura in vitro de osteoblastos. Dessa forma, VMs foram isoladas a partir de ossos de galinha embrionários e caracterizadas quanto ao seu conteúdo assim como a capacidade de iniciar a formação mineral. Caracterização por microscopia eletrônica de transmissão criogênica revelou que preparações de MVs são heterogêneas e contêm além de vesículas bilamelares, uma alta quantidade de partículas não-vesiculares, sendo essa heterogeneidade impactante na habilidade de VMs em induzir mineralização. Investigações adicionais por meio de experimentos comparativos de purificação e de mineralização demonstraram que a principal via pela qual as VMs desencadeiam a mineralização é por meio de seu maquinário enzimático, como a fosfatase alcalina, tal que a nucleação direta de mineral a partir de íons solúveis represente um processo secundário. Para acessar esse efeito secundário, a nucleação mineral induzida pela superfície das VMs foi acessada em um modelo biomimético de membrana usando monocamadas de Langmuir de lipídios sintéticos (fosfatidilcolina e fosfatidilserina) assim como lipídios nativos extraídos de VMs. O rastreamento in-situ da formação mineral nesse modelo revelou que nanodomínios enriquecidos em fosfatidilserina formados na superfície da membrana desencadeiam a nucleação mineral ao interagir com íons cálcio e fosfato. Tendo estabelecido a interação entre as VMs e a formação de mineral tanto ao nível de vesículas individuais quanto no modelo biomimético de membrana, o papel das VMs no controle da mineralização da MEC foi finalmente demonstrado a nível celular usando cultura primária de osteoblastos. Osteoblastos tratados com cloroquina, um bloqueador da autofagia, resultou em mineralização deficiente da MEC. Embora a mineralização dos osteoblastos seja reduzida em presença de cloroquina, como revelado pela coloração de cálcio por vermelho de Alizarina, microscopia eletrônica de transmissão revelou que VMs ainda estavam abundantemente presentes na MEC. No entanto, o isolamento de VMs e a caracterização de seu conteúdo revelaram expressão reduzida de proteínas relacionadas à mineralização, com uma diminuição notável na atividade da fosfatase alcalina. Essas observações no nível celular sugerem que a mineralização da MEC é deficiente se as MVs estiverem disfuncionais (ou seja, atividade de fosfatase reduzida), sugerindo que essas estruturas desempenham um papel predominante na mineralização óssea, sendo sua liberação controlada de maneira específica ao contexto celular. Em conclusão, os resultados coletivamente apresentados nesta tese confirmam a importância das MVs para a mineralização óssea, mas também oferecem novas perspectivas sobre a relação intricada entre as vesículas e a formação mineral. (AU)

• Processo FAPESP: 17/20846-2 - Explorando o papel da matriz lipídico-proteica-mineral na biomineralização óssea: uma abordagem biofísica empregando-se filmes automontados
• Beneficiário: Marcos Antonio Eufrásio Cruz
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado