Engenharia metabólica e evolução de Saccharomyces cerevisiae visando a fermentação de arabinose e xilose

Autor(es)

Paulo Emílio dos Santos Costa

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2022-04-20

Membros da banca

Leandro Vieira dos Santos; Thamy Lívia Ribeiro Corrêa; Ana Paula Jacobus

• Orientador: Leandro Vieira dos Santos

Resumo

O uso da biomassa vegetal para a produção sustentável de bioprodutos é uma alternativa promissora para reduzir o uso de fontes fósseis e mitigar os impactos ambientais decorrentes do seu consumo. Contudo, a limitação metabólica da levedura Saccharomyces cerevisiae em consumir os açúcares de cinco carbonos (C5) da biomassa, como as pentoses xilose e arabinose, é um dos principais gargalos que inviabilizam economicamente a produção. O emprego de abordagens racionais associadas a estratégias de evolução adaptativa permite a identificação de novos metabolismos e alvos genéticos que podem potencializar o consumo dessas pentoses. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo a construção de uma cepa industrial fermentadora de arabinose e xilose, bem como a identificação de bases genéticas fixadas durante procedimentos de evolução adaptativa e responsáveis por otimizar a conversão de C5. Inicialmente, cassetes de expressão gênica contendo a via metabólica de conversão de arabinose foram construídos utilizando abordagens de biologia sintética, e estavelmente integrados no genoma de uma cepa industrial fermentadora de xilose, dando origem a linhagem base PEY-AX5. Somente com o design racional, a linhagem construída não era capaz de crescer em arabinose como fonte única de carbono. Estratégias de evolução adaptativa foram aplicadas e após 65 e 190 gerações foi observado um rápido crescimento em meio contendo arabinose. A população foi capaz de fermentar a totalidade da arabinose, alcançando um rendimento de conversão de 0,42 g etanol/ g arabinose. Também foi observado o co-consumo de xilose e arabinose em fermentações contendo a mistura dos açúcares. O sequenciamento genômico será realizado nas populações evoluídas para a identificação de SNPs e CNVs fixados nas populações durante a evolução e associados com o aumento da capacidade fermentativa de arabinose. Em um projeto paralelo, foram avaliados o efeito de duas mutações benéficas para a conversão de xilose. Os genes avaliados foram ZWF1, evolvido na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, e o gene CLN3, importante ciclina do ciclo celular, além de interações epistáticas com o gene ISU1, envolvido na formação de clusteres Fe-S. Mutantes knockout e com a inserção de SNPs foram introduzidos em uma cepa fermentadora de xilose usando o sistema CRISPR-Cas9. Os ensaios fermentativos demostraram efeitos positivos na deleção dos genes, além de interação positiva entre os genes ZWF1 e ISU1, com o mutante duplo consumindo 50 g/L de xilose em menos de 32 horas e rendimento de 0,47 g de etanol/ g xilose. Com os resultados gerados no presente trabalho, conseguimos desenvolver leveduras capazes de consumir de forma eficiente a L-arabinose, além de promover o co-consumo dos açúcares C5. Após sequenciamento genômico, seremos capazes de identificar novos alvos e metabolismos responsáveis pela eficiente conversão de pentoses. Por fim, validamos os genes ZWF1 e CLN3 como novos alvos com potencial biotecnológico para conversão de xilose. O conjunto das mutações identificadas pode ser utilizado em abordagens racionais de engenharia metabólica, desenvolvendo plataformas microbianas eficientes visando a conversão de resíduos agroindustriais em bioprodutos (AU)

• Processo FAPESP: 19/06942-4 - Elucidação das bases moleculares da fermentação de arabinose e xilose em linhagens de Saccharomyces cerevisiae
• Beneficiário: Paulo Emílio dos Santos Costa
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado