Characterization of CsLIEXP1 as a new susceptibility gene to Xanthomonas citri subsp. citri and gene editing by CRISPR/Cas9 for citrus canker tolerance

Autor(es)

Reinaldo Rodrigues de Souza Neto

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2022-11-29

Membros da banca

Alessandra Alves de Souza; Marcelo Menossi; Henrique Marques Souza; Maxuel de Oliveira Andrade; Marie Anne Van Sluys

• Orientador: Alessandra Alves de Souza

Resumo

Cancro cítrico é uma doença causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A patogenicidade dessa bactéria é dependente da translocação de proteínas efetoras chamadas Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) para dentro da célula hospedeira. Essas proteínas funcionam como fatores de transcrição nas plantas, promovendo a expressão de genes de susceptibilidade a doença. Em Xcc, o PthA4 é o principal TALE, essencial para regulação de genes do hospedeiro que vão facilitar a colonização da bactéria. Esse efetor transativa o gene CsLOB1, o qual é um fator de transcrição cuja expressão está associada ao desenvolvimento dos sintomas. Embora CsLOB1 seja necessário para a indução de cancro em diferentes espécies de Citrus, outros genes podem também estar envolvidos no desenvolvimento do cancro. Desta forma, o objetivo desse estudo foi identificar novos genes de susceptibilidade de laranja doce a Xcc e usar a tecnologia CRISPR/Cas9 para edição e comprovação da funcionalidade do gene no desenvolvimento do cancro cítrico. Portanto, baseado em dados de transcriptoma, sete genes candidatos a serem regulados por PthA4 foram identificados e validados por expressão relativa. Entre eles, os genes CsLOB1 e uma expansina mostraram os mais altos níveis de expressão em todas as variedades em resposta a infecção com Xcc, mas não para Xcc-?pthA4. Em ensaios de agroinfiltração, o gene expansina não foi regulado por PthA4, mas foi induzido por CsLOB1, o qual foi induzido por PthA4, indicando que o gene expansina é indiretamente regulada por PthA4. Portanto, esse gene foi renomeado para CsLOB1-INDUCED EXPANSIN 1 (CsLIEXP1) Assim, o gene CsLIEXP1 foi caracterizado como um gene de susceptibilidade indiretamente induzido por PthA4. Para comprovar seu papel no desenvolvimento do cancro cítrico, um vetor CRISPR/Cas9 foi desenvolvido com 3 sgRNA visando a edição do primeiro exon do gene CsLIEXP1. Vinte e duas linhagens transgênicas foram obtidas, e uma foi selecionada por High Resolution Melting Analysis (HRMA) como planta possivelmente editada, o que foi comprovado por sequenciamento genético. A linhagem H_CsLIEXP1_1 apresentou edição de 6,25% de cinco nucleotídeos e 37,5% de uma timina, sendo no total de 43,75% de edição. Esta planta foi desafiada com Xcc e afetou o crescimento bacteriano e desenvolvimento de sintomas. Dessa forma, foi demonstrado que a edição do gene CsLIEXP1 interferiu no desenvolvimento dos sintomas de cancro cítrico e, consequentemente, afetou o crescimento bacteriana. Portanto, nesse estudo, um novo gene de susceptibilidade foi identificado e usando a abordagem de edição de genoma foi obtida planta mais tolerante ao cancro cítrico (AU)

• Processo FAPESP: 17/13885-1 - Uso de CRISPR/Cas9 na edição de genes de suscetibilidade de Citrus sinensis a Xanthomonas citri subsp. Citri
• Beneficiário: Reinaldo Rodrigues de Souza Neto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado