Estudo funcional e molecular da quinase humana NEK6 como alvo de drogas contra câncer de próstata

Autor(es)

Isadora Carolina Betim Pavan

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas
• Data de defesa: 2023-05-24

Membros da banca

Jörg Kobarg; Clarissa Ribeiro Reily Rocha; Ana Lucia Tasca Gois Ruiz; Marcos Rodrigo Alborghetti; Natássia Elena Búfalo

• Orientador: Jörg Kobarg

Resumo

Introdução: NIMA (Never In Mitosis, gene A)-related kinase-6 (NEK6) pertence a uma superfamília de proteínas composta por 11 membros de quinases relacionadas a NIMA. As funções da NEK6 são pouco estudadas, exceto por sua participação já evidenciada no ciclo celular. A literatura tem mostrado sua relevância no câncer de próstata resistente à castração (CPRC), evidenciando seu papel central no crescimento do tumor independente de andrógeno, sugerindo que NEK6 regula vias de sobrevivência celular, as quais não estão relacionadas com sua função no ciclo celular. No entanto, ainda não está claro quais são essas vias e mecanismos regulados por NEK6 que a fazem participar do CPRC. Objetivo: O objetivo desse estudo foi explorar a NEK6 no CPRC, avaliando os efeitos celulares na ausência da sua expressão e inibição, bem como identificar os mecanismos moleculares de sobrevivência que NEK6 regula nesse câncer. Além disso, também avaliamos a relevância da depleção e/ou inibição de NEK6 no contexto do tratamento de quimioterápicos utilizados no CPRC, tais como cisplatina e docetaxel, e do composto natural anti-tumorigênico, resveratrol. Material e métodos: Foram geradas células nocautes de NEK6 nas linhagens celulares DU-145 e PC-3 utilizando o sistema CRISPR/Cas9. O uso de um inibidor específico de NEK6 também foi testado nas células DU-145 e PC-3. Ensaios funcionais para avaliar viabilidade, capacidade clonogênica, morte celular, migração, geração de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), permeabilidade da membrana mitocondrial foram realizados nessas células. Avaliação da expressão a nível de RNA mensageiro e proteico de genes relacionados à progressão e quimioresistência no câncer de próstata foram realizados. Resultados: Os nocautes de NEK6 diminuiram a capacidade clonogênica, proliferação, viabilidade celular e a atividade mitocondrial. A depleção de NEK6 aumentou o nível de ROS intracelular; diminuiu a expressão das defesas antioxidantes (SOD1, SOD2 e PRDX3); aumentou a fosforilação de JNK, uma quinase responsiva ao estresse; e aumentou os marcadores de dano ao DNA (p-ATM e ?H2AX). A superexpressão exógena de NEK6 também aumentou a expressão dessas mesmas defesas antioxidantes e diminui ?H2AX. A depleção de NEK6 induziu a morte celular por apoptose e reduz a proteína anti-apoptótica Bcl-2. As células com falta de NEK6 têm mais sensibilidade à cisplatina. NEK6 regulou a localização nuclear de NF-?B2, sugerindo que NEK6 pode regular a atividade transcricional de NF-?B2. Portanto, NEK6 altera o equilíbrio redox, regula a expressão de proteínas antioxidantes e danos ao DNA, e sua ausência induz a morte de células DU-145. Observamos que a inibição de NEK6 sensibilizou as células DU-145 ao tratamento com docetaxel, induziu marcadores significativos de apoptose (clivagem de PARP1, BAK), reduziu as vias de sobrevivência (p65 fosforilado) e migração celular (TJP1). O inibidor de NEK6, individualmente, foi capaz de reduzir significativamente as expressões de Bcl-xL, Bad fosforilado e TJP1. O inibidor de NEK6 exibiu um IC50 atraente em DU-145 e PC-3, podendo ser um composto interessante a ser explorado no câncer de próstata. O cotratamento com docetaxel e inibidor de NEK6 reduziu significativamente a formação de colônias e a migração celular. O nocaute de NEK6 em células DU-145 e PC-3 sensibiliza as células ao tratamento com docetaxel. Resveratrol também foi capaz de inibir a expressão de NEK6 e HK2. Foi observado que NEK6 regula a expressão da enzima glicolítica HK2, conectando NEK6 com vias metabólicas no CRPC. Sugere-se que o eixo de sinalização NEK6-HK2 pode ser um possível mecanismo de regulação do resveratrol. Conclusão: NEK6 pode ser um alvo estratégico no câncer de próstata e os inidores de NEK6 devem ser explorados, bem como seu uso na combinação com quimioterápicos (AU)

• Processo FAPESP: 18/08391-2 - Estudo funcional e molecular da cinase humana NEK6 como alvo de drogas contra Câncer de Próstata
• Beneficiário: Isadora Carolina Betim Pavan
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado