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Caracterização funcional e estrutural de um inibidor de fosfolipase A2 tipo-? da serpente Bothrops alternatus: Clonagem, expressão e mapeamento da região responsável pela atividade inibitória

Texto completo
Autor(es):
Norival Alves Santos Filho
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: Ribeirão Preto.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
Data de defesa:
Membros da banca:
Suely Vilela; Auro Nomizo; Jose Cesar Rosa; Antonio Cardozo dos Santos
Orientador: Suely Vilela
Resumo

Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s. (AU)

Processo FAPESP: 08/10760-4 - Caracterização funcional e estrutural do inibidor de fosfolipases A2 Tipo-alfa da serpente Bothrops alternatus: clonagem, expressão e mapeamento da região responsável por sua atividade inibitória
Beneficiário:Norival Alves Santos Filho
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado