Mutagênese em larga escala mediada por transposon no fungo patogênico Candida albicans

Resumo

Candida albicans é a principal causa de infecções hospitalares causadas por fungos, tanto em indivíduos normais quanto em indivíduos imunocomprometidos. Pretendemos analisar genes codificadores de fatores de virulência e genes importantes para o crescimento filamentoso em C. albicans pelo uso de uma metodologia de mutagênese por inserção mediada por transposon, em larga escala. Um mini-transposon será criado e conterá um gene reporter para a análise da expressão gênica, localização celular e fenótipos de mutantes. Por se tratar de um diplóide obrigatório, o mini-transposon também possuirá dois novos marcadores dominantes que permitirão a mutagênese dos dois alelos de cada' gene, numa única transformação. Após mutagênese in vitro de bibliotecas genômicas, mini-preparações de plasmídeos serão realizadas e os insertos linearizados serão usados para a transformação de C. albicans. As cepas de leveduras assim como as cepas de bactérias serão estocadas e servirão para a identificação do gene mutado. A análise da função gênica em larga escala envolverá duas estratégias experimentais: 1) Varredura dos genes expressos durante a morfogênese. Inserções que resultarem em produção de proteína de fusão (beta-galactosidase ou GFP) em meios indutores de filamentação serão identificadas. A identidade do gene será revelada pelo sequenciamento da região flanqueadora da inserção do transposon e pela comparação desta sequência com o genoma de C. albicans, presente em bancos de dados. A caracterização adicional desses genes envolverá o knockout gênico para produção de mutações nulas e caracterização fenotípica in vitro e in vivo. 2) Testes de virulência. Inseriremos no transposon "barras de identificação ou código de barras" (em inglês, bar codes) que são pequenas sequências de DNA que rotulam cada mutante e permitem a execução de experimentos de competição de mutantes in vivo. As cepas de levedura transformantes serão combinadas em um pool de transformantes para posterior inóculo em camundongos. Após infecção dos camundongos com as cepas de leveduras mutantes, os rótulos serão amplificados via PCR e hibridados contra filtros contendo um array das correspondentes "barras de identificação". A comparação dos sinais de hibridação do DNA proveniente das cepas presentes antes do inóculo ou recuperadas do animal dias após o inóculo, identificarão mutações em genes necessários para a sobrevivência e crescimento no hospedeiro, ou seja, genes que potencialmente codificam fatores de virulência. Em conjunto, nesse trabalho formaremos um banco de mutantes de inserção que nos permitirá a identificação em larga escala dos genes codificadores de fatores de virulência bem como aqueles expressos durante a filamentação. Os dados serão úteis no estabelecimento de novas estratégias terapêuticas para o combate dessa micose. (AU)