Estudos de renaturacao de proteinas agregadas utilizando altas pressoes hidrostaticas

Resumo

A necessidade de produção eficiente de proteínas recombinantes tem crescido e provavelmente continuará a crescer. As bactérias Escherichia coli são as hospedeiras mais utilizadas para produzir essas proteínas, mas resultam no acúmulo de depósitos de proteínas insolúveis e inativas no seu interior, denominados de corpos de inclusão. A expressão de proteínas em corpos de inclusão possui algumas vantagens como a produção de elevados níveis de proteínas altamente enriquecidas. O desafio é tirar vantagem dos altos níveis de expressão das proteínas em corpos de inclusão, convertendo proteínas inativas e agregadas em produtos solúveis e bioativos. A recuperação de proteínas nativas a partir de agregados em corpos de inclusão citoplasmáticos em E. coli é um obstáculo na produção de proteínas recombinantes, tanto para finalidade de pesquisa quanto para a produção industrial. Os processos tradicionais de desnaturação das proteínas nos agregados utilizando-se altas concentrações de agentes caotrópicos seguidos de renaturação geralmente levam a baixos rendimentos de proteínas nativas, pois as porcentagens de reagregação freqüentemente são altas. É já bem descrito na literatura que altas pressões hidrostáticas agem sobre soluções protéicas desfavorecendo interações hidrofóbicas e eletrostáticas que causam a agregação de proteínas. A solubilização e a renaturação de proteínas recombinantes agregadas em corpos de inclusão citoplasmáticos produzidos em E. coli podem ser realizadas em uma só etapa em condição de pressões da ordem de 100 a 300MPa. Deveremos estabelecer e otimizar processos de renaturação em altas pressões hidrostáticas da proteína "green fluorescent protein" (GFP) expressa como agregados em corpos de inclusão em Escherichia coli. A proteína "green fluorescent protein" (GFP) é produzida pelo cnidário Aequorea victoria que emite fluorescência na zona verde do espectro visível, por isso a GFP tem sido utilizada como um gene repórter. A fluorescência emitida pela GFP no comprimento de onda de 510 nm é dependente de aquisição de sua conformação nativa, o que facilita o monitoramento do processo de renaturação desta proteína a partir da proteína recombinante agregada presente nos corpos de inclusão citoplasmáticos pela aplicação de altas pressões. Até onde sabemos, não existe no Brasil nenhum outro laboratório que venha se interessando no estudo sistemático da renaturação de corpúsculos de inclusão por meio da utilização de altas pressões hidrostáticas ou por qualquer outro método, de forma sistemática e de aplicabilidade geral. (AU)