Análise da adesão e o comportamento celular em substrato contendo nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNTs)

Resumo

O objetivo geral deste projeto é analisar proteínas envolvidas com o processo de adesão e sobrevivência de fibroblastos embrionários e de linhagens celulares permanentes em substrato contendo MWCNTs e testar diferentes tipos de substratos que possam favorecer a viabilidade celular. Objetivos Específicos: * Analisar diferentes tipos de substratos contendo MWCNTs, verificando a preferência celular através da aderência, sobrevivência e proliferação das células. * Comparar o cultivo de células de cultura primária e cultura permanente nos diferentes substratos contendo MWCNT. * Analisar, através de imunohistoquímica, proteínas de adesão envolvidas com a interação e sobrevivência das células cultivadas sobre o substrato contendo MWCNT. Ou ainda, de proteínas envolvidas com apoptose celular quando for o caso. Metodologia: 1. PRODUÇÃO DE NANOTUBOS DE CARBONO DE PAREDES MÚLTIPLAS (MWNTS). Processo de deposição dos NCPMs. Baseado no artigo de HUANG et al, utilizaremos silício polido, revestido por filmes de SiO2 e Ni, como substrato, os quais serão depositados por e-beam. Para deposição dos nanotubos, serão utilizados um reator de plasma de microondas, onde uma etapa de prétratamento será realizada, a fim de criar "nanoclusters" de níquel, a partir dos quais os NCPMs serão nucleados. 2. LINHAGEM CELULAR. As células utilizadas nos experimentos serão de duas naturezas: * Cultura primária: fibroblastos embrionários de camundongos C57BL/6 e C57BL/6-GFP com 12.5 a 14.5 dias de desenvolvimento embrionário; * Cultura permanente: fibroblastos L929 de camundongo. 2.1. Extração de fibroblastos embrionários (MEFs)Os fibroblastos serão extraídos conforme protocolo descrito em "Manipulating the Mouse Embryo- A Laboratory Manual"- 2nd edition- 1994 (Hogan et al., 1994). 3. ANÁLISE DE ADESÃO PREFERENCIAL. Esta análise tem o objetivo de verificar se substratos para cultivo celular, produzidos a base de MWCNT, têm característica preferencial para a adesão celular. Esta análise será feita cultivando fibroblastos embrionários que produzem a proteína GFP (green fluorescent protein) em placa contendo 3 tipos de substrato: um substrato controle, com filme de SiO2 e Ni; um substrato de SiO2 e Ni revestido com gelatina 0,1%(p/v); e um substrato de SiO2 e Ni com deposição de MWNTs. 4. IMUNOHISTOQUÍMICA. Para avaliar a localização e distribuição da proteína nos órgãos será realizada reação de imunomarcação das células e será observada em microscopia de fluorescência das amostras com diferentes tipos de substratos contendo CNT, como os já citados no ítem 3. Para a imunomarcação as células serão incubadas com anticorpos primários, que reconhecem proteínas envolvidas na adesão celular (FAK; paxilina; caderina; entre outras) e proteínas envolvidas com apoptose (caspases) quando for o caso. Estes anticorpos serão reconhecidos por anticorpo secundário Alexa fluor (Molecular Probes) conjugado com fluorocromo na próxima etapa da reação. E então, lâminas serão montadas e observadas com microscópio de fluorescência em cumprimento de onda específico de acordo com o fluorocromo utilizado. (AU)