Identificação de proteínas reguladoras das estruturas nucleares ricas em FBXO25 (FANDs) por GF-TAP

Resumo

Em 1999, Cenciarelli e colaboradores identificaram pela primeira vez em análises in silico a proteína FBXO25, a qual apresenta 65% de identidade com Atrogin-1. FBXO25 é uma das 70 proteínas que possuem um domínio de interação proteína-proteína do tipo F-box (FBP), as quais atuam como fatores de especificidade para a família mais estudada de E3 ubiquitina-ligases humanas, as do tipo RING (Really Interesting New Gene-Box 1), que são complexo oligoméricos denominados SCF1, compostos por Skp1, Cullin1, RBX1 e uma FBP, e envolvidos na ubiquitinação de proteínas para degradação via Sistema Ubiquitina Proteassoma (SUP). Menos de 10% das FBPs tem sua função e substratos identificados. Em trabalhos anteriores, nosso grupo mostrou que FBXO25 acumula-se no núcleo celular formando novas estruturas subnucleares denominadas FANDs (FBXO25-Associated Nuclear Domains) que estão envolvidas na ubiquitinação nuclear. Recentemente, mostramos a identificação de 132 possíveis ligantes de FBXO25 a partir da combinação de duas estratégias proteômicas, GF-TAP (GST/FLAG Tandem Affinity Purification) e YTHS (Yeast Two Hybrid System). Porém, nenhum dos estudos funcionais utilizados nos permitiu a identificação direta de substratos do complexo SCF1FBXO25, o que é fundamental para sua caracterização funcional como uma E3 ubiquitina-ligase. Deste modo, com o objetivo de identificarmos substratos do complexo SCF1FBXO25 por GF-TAP, neste projeto utilizaremos a estratégia de superexpressar juntamente com FBXO25, Cullin1 dominante negativa (Cul1DN), a qual possui apenas o domínio de interação com Skp1 sem a região de interação com RBX1. Com isso, na condição de superexpressão de FBXO25, seus substratos serão preservados pelo fato de não serem ubiquitinados e degradados pelo SUP. Além disso, nosso grupo observou que a agregação de FBXO25 nos FANDs é fase-dependente do ciclo celular, e que a inibição da transcrição celular por ActinomicinaD (ActnD) provoca uma redistribuição de FBXO25 no núcleo de células Hela, não mais acumulando-a nos FANDs, portanto um outro objetivo deste trabalho é recuperar por GF-TAP, ligantes de FBXO25 que regulam formação dos FANDs em células HEK293T transfectadas com FBXO25-GST-FLAG tratadas ou não com ActnD.