Análises in vivo e in vitro da proteína anti-inflamatória anexina A1 em modelos oculares experimentais após indução por endotoxina

Resumo

A inflamação é o principal fator contribuinte para inúmeras desordens oculares, inclusive cegueira. O tratamento farmacológico desses processos inflamatórios, especialmente a uveíte, inclui corticosteróides e agentes quimioterápicos. No entanto, os efeitos colaterais desses fármacos (glaucoma e citotoxidade) limitam os seus usos e estimulam buscas por novas estratégias terapêuticas. A anexina-A1 (ANXA1) é uma proteína de 37 kDa que possui intensas atividades anti-inflamatórias, contudo, é pouco explorada em tecidos oculares normais e inflamados. No presente estudo analisaremos, in vivo e in vitro, a expressão, a localização e o mecanismo de ação da proteína endógena ANXA1 nos tecidos oculares e nas células do epitélio pigmentado da retina (EPR), em condições normais e após indução ao processo inflamatório por endotoxina. Investigaremos, ainda, o possível efeito anti-inflamatório da administração do peptídeo Ac2-26 da ANXA1 nestas condições experimentais. Ratos machos (Rattus novergicus) serão anestesiados e inoculados na pata direita com 1 mg/kg de lipopolissacarídeo (LPS) para o desenvolvimento da uveíte e divididos em grupos experimentais (n=10 por grupo): EIU induzida e não tratada por 24 e 48 horas, EIU induzida e tratada com aplicações tópicas (4/4hs) ou sistêmica do peptídeo Ac2-26 (1mg/kg). As expressões das proteínas ANXA1, ANXA1 fosforilada em serina (ANXA1-S27-PO4) e tirosina (ANXA1-T21-PO4) e do receptor FPR²2 nos tecidos oculares serão verificadas por imuno-histoquímica. Os efeitos do peptídeo Ac2-26 serão avaliados, 24 horas após a indução da EIU, por meio das análises quantitativas de leucócitos e das dosagens de TNF-±, IL-1² e NO, e da expressão de COX-2 nos tecidos e/ou no humor aquoso de olhos tratados com o peptídeo Ac2-26, sem tratamentos e controles. Nos esudos in vitro investigaremos as expressões da ANXA1 e da COX-2, pelo método imunocitoquímico ultra-estrutural, nas células ARPE-19 (derivada do EPR humano normal) após ativação pelo LPS, e o possível efeito anti-inflamatório da administração da ANXA1 nessas células nos tempos de 60, 120, 240 minutos, 24 e 48 horas. Os sobrenadantes serão coletados para as dosagens dos mediadores pró-inflamatórios TNF-±, IL-1², IL6, IL8, NO e MCP1. A atividade do NF-ºB será quantificada pelo ensaio de eletromobilidade em gel (EMSA). O estudo da proteína ANXA1 endógena e do seu peptídeo mimético Ac2-26 nos tecidos oculares de ratos, in vivo, e nas células do EPR humanas, in vitro, em condições normais e após o estímulo com endotoxina, é extremamente importante, pois poderá ocasionar novas alternativas terapêuticas para o tratamento de processos inflamatórios oculares, em especial, a uveíte. (AU)