Heterorresistência ao fluconazol em agentes da criptococose

Resumo

A criptococose é causada por leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus que abrange duas espécies principais: C. neoformans e C. gattii. Alguns estudos indicam que Cryptococcus, em particular cepas de C. gattii, tem alto potencial para desenvolver resistência a fluconazol in vitro, o que poderia explicar as falhas terapêuticas e recidivas, observadas com frequência, em pacientes afetados por esta doença sob tratamento antifúngico. Cepas de C. gattii parecem ser mais virulentas, uma vez que infectam mais comumente pacientes imunocompetentes, do que cepas de C. neoformans e estudos com animais corroboram esta idéia. Os triazóis são a maior classe de drogas antifúngicas usadas na clínica médica e fluconazol é empregado como terapia de longo prazo, para manejo dos casos de criptococose associados à AIDS, o que pode levar ao aparecimento de cepas resistentes. Interessante é o fato de que subpopulações de células podem ter crescimento variado in vitro frente a determinada concentração de fluconazol definido pelo seu perfil de heterorresistência à droga. Poucos dados norte-americanos demonstram que todas as estirpes ambientais e clínicos testados de C. gattii e C. neoformans manifestam heterorresistência ao fluconazol. Não há dados disponiveis, segundo literatura consultada, relacionados a isolados de Cryptococcus oriundos da América Latina. Nosso objetivo, neste estudo, é investigar o nível de heterorresistência ao fluconazol em agentes de criptococose. O nível de heterorresistência de 50 cepas clínicas de C. gattii será comparado ao de 50 cepas clínicas de C. neoformans. As amostras são da micoteca do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo e foram, previamente, tipadas molecularmente com cepas-padrão (fornecidas por Dr.Wieland Meyer). Todas as cepas clínicas e de referência foram armazenadas em glicerol (15%) sob temperatura de -20°C até sua utilização e foram mantidas em ágar YPD (2% de glicose, extrato de levedura a 1%, peptona a 2%) a 25°C durante o estudo. Inicialmente, a concentração mínima inibitória (MIC) de fluconazol será determinada usando E-test (bioMérieux, Fr) para todas as 100 cepas para determinar da droga. Em seguida, uma triagem inicial para heterorresistência será executada. Suspensões de células de todas as cepas serão realizadas em solução salina estéril e plaqueadas em ágar YPD contendo várias concentrações de fluconazol (4 a 128 mg/L). O padrão de crescimento será lido após 72h de incubação a 30°C. Os isolados serão considerados como, possivelmente, heterorresistente se apenas uma fração da população crescer em placa contendo concentração maior do que a concentração que permite 100% de crescimento de células viáveis. Desta maneira, o nível de heterorresistência fluconazol para cada isolado será determinada. Para isolar os subclones altamente resistentes, os clones heterorresistentes serão isolados e inoculados em ágar YPD contendo concentrações crescentes (ao dobro) de fluconazol (até 256 mg/L). As placas de cada repique serão incubadas a 30°C durante 72 a 96h. Com essa etapa, será analisada a capacidade da subpopulação resistente de cada isolado em se adaptar, de forma gradual, a maiores concentrações de fluconazol. Finalmente, será verificado se a heterorresistência ao fluconazol é transitória e como as cepas tornaram-se suscetíveis depois de serem repicadas em série de placas sem adição de fluconazol. Subclones altamente resistentes (>64 mg/L), a partir de cepas que manifestaram heterorresistência >16 mg/L, serão utilizados nesta fase do estudo. Assim, será possível também determinar a extensão da resistência na subpopulação e confirmar se essa ocorrência é uma resposta adaptativa reversível à presença da droga. O estudo da heterorresistência pode revelar um novo mecanismo adaptativo para sobrevivência sob pressão de fluconazol e poderá oferecer uma visão útil para o manejo de pacientes sob terapia prolongada com fluconazol.