Novo modelo de expressão heteróloga para estudos de proteínas de membrana - oócitos de Rana catesbeiana: caracterização da expressão e função de transportadores de amônia (NH3/NH4+) em oócitos de Rana catesbeiana

Resumo

Transporte de gás através das membranas celulares é fundamental na fisiologia e fisiopatologia. Atualmente, várias linhas de argumentos experimentais desafiam a visão clássica de que todos os gases atravessam todas as membranas celulares com grande facilidade, simplesmente se dissolvendo na matriz lipídica. As primeiras evidências desafiando esta teoria veio de observações do laboratório do Dr. Walter F. Boron, onde demonstraram que 1) a membrana apical de células glândulas gástricas são impermeáveis a CO2 e NH3, e a membrana apical de criptas colônicas são impermeáveis a NH3, 2) o gás CO2 pode passar através do canal para água Aquaponia 1 (AQP1) expressa em oócitos de Xenopus laevis, fornecendo, então, a primeira evidência da passagem de um gás (CO2) por um canal (AQP1). No entanto, a existência de canais para gases somente faz sentido se 1) a permeabilidade intrínseca da bicamada lipídica ao gás em questão é baixa quando comparada com a contribuição dos canais, 2) o gradiente que move o transporte é baixo, e 3) a demanda fisiológica é alta. Os oócitos de Xenopus são utilizados extensivamente como modelo de expressão heteróloga "in vivo" de proteínas de membrana - transportadores e canais - sendo valioso para estudar a eletrofisiologia e biologia molecular de novas proteínas. No entanto, devido às restrições impostas pelas entidades governamentais para importação dessas rãs no Brasil, tornou-se necessário buscar um modelo alternativo de expressão heteróloga, utilizando oócitos de rãs que são comercializadas no Brasil, como as rãs da espécie Rana catesbeiana. Portanto, estamos utilizando os oócitos de Rana como sistema de expressão heteróloga de proteínas de membrana para investigar através de estudos de biologia molecular e eletrofisiologia os mecanismos de transporte da molécula neutra NH3 através de proteínas específicas: AQPs 3, 7, 8 e 9, proteínas glicosiladas RhAG, RhBG e RhCG e os transportadores de ureia UT-B e UT-A1. Estas proteínas são expressas em tecidos que envolvem a homeostase ou o transporte de NH3/NH4+. A permeabilidade a NH3 desses oócitos será estudada através de microeletrodos da técnica de medidas do pH superfície. Esta técnica permite analisar simultaneamente as variações no potencial de membrana (Vm), pH intracelular (pHi) e pHS causadas pelo fluxo resultante de NH3 entre o espaço extra e intracelular de oócitos de Rana após perfusão contínua de soluções específicas. Se NH3 entrar na célula, ocorre uma queda transiente no pHS com posterior recuperação para um valor próximo do valor basal inicial. A queda no pHS ocorrerá porque a entrada de NH3 para a célula, levará à queda da concentração de NH3 no lado extracelular da membrana. Por sua vez, o déficit de NH3 na superfície externa da membrana é reposto pela NH3 que vem diretamente da solução que banha a célula (solução do "seio" extracelular), e da NH3 que se forma devido à ocorrência da seguinte reação na superfície celular: NH4+ ® NH3 + H+. O novo H+ que se origina desta reação causa uma mudança de pHS que é detectada pelo microeletrodo de pH presente na superfície celular. Dessa forma, a magnitude da queda no pHS representa um índice da permeabilidade da membrana a NH3. Portanto, o trabalho proposto é parte de um projeto projetado para entender como NH3 move-se através de proteínas de membrana e, de forma mais integrada, a importância fisiológica de canais para o gás NH3. Quando concluído, este trabalho fará parte de trabalhos que demonstram uma mudança na teoria de gases atravessam as membranas por difusão. (AU)