Impacto metabólico de perturbações genéticas transitórias em Escherichia coli e Pseudomonas putida

Resumo

Apesar da imensa quantidade de dados "ômicos" disponíveis, características relevantes dos seres vivos tais como a autoconstrução, robustez e reorientação dos fluxos metabólicos são pouco compreendidas. Nós propomos uma nova abordagem experimental para enfrentar este desafio: provocaremos perturbações transitórias após a adição de um indutor não hidrolisável. Os casos de estudo serão 1) a substituição temporária em Escherichia coli da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase nativa que prefere NAD (NAD-G3PDH) por a gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase não fosforilante e dependente de NADP (NADP-G3PDH) de Streptococcus mutans; e 2) a expressão temporal da fosfofructokinase (PFK) de E. coli em Pseudomonas putida. Para conseguir a substituição temporal da NAD-G3PDH pela NADP-G3PDH em E. coli o gene codificador para a NAD-G3PDH será substituído por uma versão modificada, degradável por uma protease induzível. Os genes codificadores para esta protease e a NADP-G3PDH (ambos sob controle do promotor Lac) serão induzidos após a adição de isopropil-tio-galatosidio (IPTG). Em P. putida, o gene pfkA (sob controle do promotor Lac) será expressado utilizando um plasmídeo adequado. Utilizando cultivos contínuos será possível controlar a adição e eliminação do IPTG e, concomitantemente, observar as distribuições dos fluxos metabólicos, as concentrações dos principais metabólitos e os padrões de transcrição antes, durante e depois das perturbações. Os dados coletados serão utilizados para modelar as respostas fisiológicas após este tipo de modificações.