Uso de CRISPR/Cas9 na edição de genes de suscetibilidade de Citrus sinensis a Xanthomonas citri subsp. citri

Resumo

Cancro cítrico é uma doença causa por Xanthomonas citri subsp. citri. A patogenicidade desta bactéria dependente da translocação de proteínas efetoras chamadas Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) para dentro da célula hospedeira. Essas proteínas funcionam como fatores de transcrição na planta. Elas reconhecem regiões específicas no promotor de genes alvo conhecidos como Effector Binding Elements (EBE). A ligação dos TALES com as regiões EBEs correspondentes promove a transcrição de genes de susceptibilidade a doença. Em X. citri, PthA4 é o principal TALE e essencial para elicitar o cancro cítrico. Esse efetor transativa o gene LOB1 em laranja doce, o qual a expressão é associada com o desenvolvimento de sintomas. Embora LOB1 seja exigido para a indução dos sintomas, dados de microarranjo e RNA-seq sugerem que outros genes estão envolvidos no desenvolvimento do cancro e poderiam ser alvos diretos para o PthA4. Portanto, as sequencias EBE desses genes poderiam ser bons alvos para edição de genoma via CRISPR-Cas9 visando resistência a X. citri. Baseado em resultados prévios de transcriptoma e bioinformática, nós selecionamos nove genes como potenciais alvos para PthA4. O perfil de expressão desses genes foi analisado em três variedades comerciais de laranja doce usadas no Brasil. Entre os nove genes testados, expansina, pectato liase C e LOB1 apresentaram um alto nível de expressão em todas as variedades de laranja doce em resposta a X. citri, mas não para X. citri mutante para PthA4. Por conta disso, os promotores desses genes foram clonados e sequenciados para desenho da sgRNA e construção do vetor CRISPR-Cas9 e também para verificar a possível regulação desses genes por PthA4. Portanto, o objetivo dessa proposta é confirmar que a expansina e pectato liase C são diretamente regulados por PthA4 e usar LOB1 como prova de conceito. Após isso, usar o vetor CRISPR-Cas9 para obter plantas editadas resistentes a X. citri.