Melhoramento da rota de produção de etanol por bactérias termofílicas a partir do engenheiramento da ferredoxina: expressão heteróloga e avaliação in vitro

Resumo

É amplamente reconhecido que compreender e manipular o metabolismo redox é fundamental para a engenharia metabólica destinada a alcançar altos títulos e rendimentos e, na verdade, muitas vezes mais importante do que a manipulação do metabolismo do carbono. A ferredoxina é uma proteína central no metabolismo do etanol em C. thermocellum, onde atua como aceptora de elétrons para PFOR, bem como doadora de elétrons para a redução de NADH (através de RNF), que é posteriormente utilizado na redução de acetil- CoA para etanol. As propriedades eletrônicas e estruturais da ferredoxina influenciam a rede de fluxo metabólico de duas maneiras: 1) A taxa de transferência de elétrons nas reações dependentes da ferredoxina é parcialmente governada pela geometria e especificidade das interações proteína-proteína transitória (PPIs) formada entre a ferredoxina e suas enzimas parceiras. 2) O potencial E0 da ferredoxina desempenha um papel no estabelecimento da força motriz termodinâmica (G) para uma determinada reação, que por sua vez afeta a quantidade de enzima necessária para sustentar um fluxo desejado. Apesar desse papel central, a ferredoxina é provavelmente o portador de elétrons menos compreendido em C. thermocellum. Além disso, sendo uma proteína, também é distinta entre os portadores de elétrons por ser passível de engenharia de proteínas, permitindo-nos modificar suas propriedades estruturais e eletrônicas para otimizar o fluxo de elétrons em direção ao etanol. É, então, proposta uma abordagem combinada de engenharia bioquímica e engenharia de proteína com o objetivo de compreender e manipular a ferredoxina para melhorar a produção de etanol. Na abordagem bioquímica, haverá a purificação e caracterização da ferredoxina de C. thermocellum e T. saccharolyticum. Os potenciais E0 serão determinados por meio de voltametria cíclica realizada em ferredoxina imobilizada em uma célula eletroquímica. Esses resultados, quando combinados com resultados de experimentos metabolômicos, permitirão determinar o ”G para as reações de transferência de elétrons relevantes, a fim de prever quantitativamente modificações no potencial de ponto médio da ferredoxina que poderiam melhorar o fluxo de etanol. A segunda abordagem é, a partir de resultados de engenharia de proteínas, gerar duas bibliotecas de ferredoxinas mutantes: uma com E0 alterado por mutação de aminoácidos nos domínios de ligação de aglomerados de ferro-enxofre conservados e outra com PPIs alterados por mutação de aminoácidos na superfície e avaliar seu efeito no rendimento do etanol. Uma vez que ainda não é possível prever essas propriedades da sequência primária, será inicialmente desenvolvida uma modesta biblioteca em E. coli com base na literatura anterior e será caracterizado o potencial E0 conforme descrito acima. Um pequeno subconjunto desses mutantes com E0's abrangendo o intervalo identificado a partir das previsões na primeira abordagem será então transformado em C. thermocellum e os resultados da fermentação serão analisados. Para a biblioteca com PPIs alterados, os candidatos serão inicialmente testados em ensaios in vitro com PFOR e RNF para identificar um subconjunto de mutantes que melhoram a atividade. Estes serão, então, transformados em C. thermocellum para avaliar o impacto na produção de etanol. O benefício dessa abordagem é que ela se baseia na modificação de uma única pequena proteína para melhorar a eficiência do fluxo de elétrons para o etanol, em vez de superexpressar grandes enzimas metabólicas, que podem impor uma carga metabólica adicional à célula.