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Improved production of the recombinant phospholipase A1 from Polybia paulista wasp venom expressed in bacterial cells for use in routine diagnostics

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Autor(es):
Perez-Riverol, Amilcar ; Musacchio-Lasa, Alexis ; Romani Fernandes, Luis Gustavo ; Aparecido dos Santos-Pinto, Jose Roberto ; Esteves, Franciele Grego ; Bazon, Murilo Luiz ; Zollner, Ricardo de Lima ; Palma, Mario Sergio ; Brochetto-Braga, Marcia Regina
Número total de Autores: 9
Tipo de documento: Artigo Científico
Fonte: 3 BIOTECH; v. 10, n. 5, p. 12-pg., 2020-04-27.
Resumo

Phospholipase A1 (PLA1) is one of the three major allergens identified in the venom of P. paulista (Hymenoptera: Vespidae), a clinically relevant wasp from southeastern Brazil. The recombinant form of this allergen (rPoly p 1) could be used for the development of molecular diagnostic of venom allergy. Early attempts to produce rPoly p 1 using Escherichia coli BL21 (DE3) cells rendered high yields of the insoluble rPoly p 1 but with low levels of solubilized protein recovery (12%). Here, we aimed to improve the production of rPoly p 1 in E. coli by testing different conditions of expression, solubilization of the inclusion bodies and protein purification. The results showed that the expression at 16 degrees C and 0.1 mM of IPTG increased the production of rPoly p 1, still in the insoluble form, but with high solubilized protein yields after incubation with citrate-phosphate buffer with 0.15 M NaCl, 6 M urea, pH 2.6 at 25 oC for 2 h. The venom allergen was also cloned in pPICZ alpha A vector for soluble expression as a secreted protein in Pichia pastoris X-33 cells, rendering almost undetectable levels (nanograms) in the culture supernatant. In contrast, a sevenfold increase of the solubilized and purified rPoly p 1 yields (1.5 g/L of fermentation broth) was obtained after improved production in E. coli. The identity of the protein was confirmed with an anti-His antibody and MS spectra. Allergen-specific IgE (sIgE)-mediated recognition was evaluated in immunoblotting with sera of allergic patients (n = 40). Moreover, rPoly p 1 showed high levels of diagnostic sensitivity (95%). The optimized strategy for rPoly p 1 production described here, will provide the amounts of allergen necessary for the subsequent protein refolding, immunological characterization steps, and ultimately, to the development of molecular diagnostic for P. paulista venom allergy. (AU)

Processo FAPESP: 19/02298-3 - Caracterização do potencial imunológico do antígeno recombinante 5 do veneno de Polybia paulista
Beneficiário:Murilo Luiz Bazon
Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
Processo FAPESP: 17/07988-2 - Avaliação biológica e inflamatória dos efeitos do antígeno 5 do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae) na forma recombinante, sobre células de linhagem macrofágica
Beneficiário:Murilo Luiz Bazon
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
Processo FAPESP: 14/13936-7 - Alérgenos de veneno da vespa social Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae): expressão recombinante em leveduras para melhorar o diagnóstico e imunoterapia específica para alergia ao veneno de himenópteros
Beneficiário:Márcia Regina Brochetto Braga
Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo FAPESP: 17/10373-0 - Perfilagem peptidômica e caracterização estrutural-funcional das vesículas lipídicas presentes na teia da aranha Nephila clavipes
Beneficiário:Franciele Grego Esteves
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
Processo FAPESP: 13/26451-9 - Bioprospecção e Análise Estrutural das Proteínas da Seda de Artrópodes por uma Abordagem Proteômica Utilizando um Sistema nanoLC-ESI-CID/ETD
Beneficiário:José Roberto Aparecido dos Santos-Pinto
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Processo FAPESP: 15/14220-8 - Caracterização proteometabolômica dos componentes da teia da aranha Nephila clavipes utilizados na estratégia de captura de presas
Beneficiário:Franciele Grego Esteves
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado