Determinação do perfil molecular de microRNAs em Displasia Neuronal Intestinal Tipo B

Resumo

A Displasia Neuronal Intestinal Tipo B (DNIB) é uma entidade patológica, do grupo das doenças neuromusculares gastrointestinais, caracterizada por complexas alterações do sistema nervoso entérico. Apesar de recentes avanços no estudo desta doença, ainda restam lacunas no que diz respeito a sua definição, critérios diagnósticos e possibilidades terapêuticas, o que faz com que o principal objetivo da investigação científica seja o esclarecimento de sua etiopatogenia e fisiopatologia. As alterações histopatológicas que caracterizam a DNIB parecem se originar de uma alteração primária, determinada geneticamente, que exerce influência direta no desenvolvimento embriológico dos tecidos derivados da crista neural. Estudos recentes têm investigado o papel dos comandos genéticos e moleculares na migração e desenvolvimento das células do sistema nervoso entérico. Diferentes estudos em animais demonstraram que determinadas mutações podem determinar megacólon e hiperplasia dos plexos nervosos mioentéricos. Entretanto, estes mesmos achados não foram encontrados em pacientes com DNIB. Os microRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos de aproximadamente 19 a 25 nucleotídeos de comprimento, não codificadores de proteínas, mas que atuam na regulação de uma grande proporção de genes no genoma humano. Os avanços na descoberta dos miRNAs como reguladores da expressão gênica e seu papel em diferentes patologias sugerem que essas moléculas representam biomarcadores robustos para o diagnóstico, prognóstico e como potenciais alvos terapêuticos em doenças humanas. Desta forma, a avaliação da expressão de miRNAs circulantes no sangue periférico e em amostras de biópsias de reto de pacientes com DNIB pode trazer informações valiosas para o esclarecimento da etiopatogenia e fisiopatologia desta doença, representando um passo fundamental para posteriores progressos relacionados ao diagnóstico e tratamento da DNIB. Objetivo: Determinar o perfil global de expressão de miRNAs circulantes e em amostras de tecido de biópsias de reto de pacientes com DNIB. Metodologia: Serão analisados 63 pacientes, com idade de 0 a 15 anos e com diagnóstico histopatológico de DNIB, realizado a partir da análise histopatológica de biópsias do reto, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp, no período de 1998 a 2010. Os pacientes serão convocados para a coleta de uma amostra de sangue (5ml) para extração de RNA e análise de expressão de miRNAs circulantes. Em um segundo momento, os materiais de biópsias de reto dos pacientes que aceitarem participar do estudo serão recuperados para a coleta de amostras de tecido destes blocos para análise molecular de expressão de miRNAs. A análise de expressão global de miRNAs será realizada através da plataforma TaqMan® Array Human MicroRNA A Cards v2.0, que consiste em um cartão com sondas liofilizadas, o qual possibilita a quantificação precisa de 374 miRNAs humanos e é otimizado para uso com amostras de arquivo (FFPE) e amostras de fluidos corporais. Nesta plataforma estão incluídos controles (miRNAs endógenos) para normalização dos dados, além de um controle negativo. A análise dos dados será realizada utilizando o programa RQ Manager v1.2 (Life Technologies). Algorítimos estatísticos utilizando One-Way ANOVA e clusterização hierárquica serão aplicados com o objetivo de identificar quais miRNAs apresentam expressão significativamente desregulada em amostras de biópsia e sangue periférico de pacientes com DNIB.