Validação funcional de inibidores da via de sinalização do Sonic Hedgehog em leiomioma e leiomiossarcoma uterinos in vivo e in vitro

Resumo

O leiomioma e o leiomiossarcoma são tumores de origem mesenquimal que se desenvolvem no útero. Essas neoplasias apresentam comportamento clínico variável, comprometendo a fertilidade e podendo até levar a morte. O leiomioma é um tumor benigno comumente encontrado nas mulheres em idade reprodutiva. Já o leiomiossarcoma representa cerca de 40% dos sarcomas do útero. Tanto o leiomiossarcoma quanto o leiomioma são neoplasias miometriais que apresentam o mesmo padrão de diferenciação celular, porém com progressão clínica completamente diferente. Diversos estudos têm demonstrado que a ativação aberrante da via de sinalização do Sonic Hedgehog (SHH) está relacionada ao desenvolvimento de vários tipos de câncer, uma vez que desempenha papel importante na proliferação e diferenciação celular. Em trabalho anterior, nosso grupo avaliou o perfil de expressão de moléculas envolvidas na via do SHH nos tumores mesenquimais do útero. As proteínas SMO, GLI1 e SHH mostraram-se hiperexpressas nos leiomiossarcomas, seguidos pelos leiomiomas e ausentes no miométrio normal adjacente. Esses resultados despertaram o interesse em avaliar o potencial terapêutico de inibidores da via nesses tumores, pois algumas dessas proteínas já foram inibidas em outras neoplasias com resultados muito promissores. Desse modo, o presente projeto objetiva avaliar, in vitro e in vivo, a ação de inibidores da via de sinalização do Sonic Hedgehog em leiomiomas e leiomiossarcomas. Para isso, inicialmente, serão utilizadas linhagens celulares que serão submetidas à inativação de genes específicos da via do SHH por RNAi ou por tratamento com inibidores específicos de SMO (GDC 0449, LDE 225 e ciclopamina); GLI 1 (GANT 56, GANT 61, IPH 1 e IPH 6) e SHH (Robotinikinin). As células serão, após confirmação da inibição dos alvos, avaliadas quanto à capacidade de formar tumores em modelo animal. Nesta etapa serão, tentativamente, avaliados os grupos: GCi (controle - inoculado fibrobastos+RNAi), GLMi (leiomioma+RNAi), GLMSi (leiomiossarcoma+RNAi). Em cada grupo serão utilizados 3 animais e a injeção das células será por via subcultânea. Em paralelo, a partir dos dados gerados na etapa anterior de inibição por fármacos específicos, os inibidores mais eficazes serão testados em cultura primária de células obtidas de até 10 pacientes com leiomioma e leiomiossarcoma, submetidas à cirurgia no ambulatório de miomas da Disciplina de Ginecologia da Faculdade de Medina da USP. Após análise conjunta dos dados de cultura, serão selecionados até três inibidores para avaliação de seus efeitos in vivo. Nesta etapa serão utilizadas 20 camundongas, divididas em 5 grupos de 4 animais, para cada inibidor testado, a saber: G1, grupo controle (somente tratamento); G2, animais inoculados com células de leiomioma; G3, animais inoculados com células de leiomioma e tratados; G4, animais inoculados com células de leiomiossarcoma; G5, animais inoculados com células de leiomiossarcoma e tratados. O experimento será realizado em duplicata e serão avaliados os efeitos do tratamento nos animais (toxicidade), no tamanho dos tumores induzidos e na expressão dos genes e proteínas alvo. A eficiência dos inibidores nas células cultivadas e tumores induzidos será avaliada por Western Blott e PCR em tempo real tanto para moléculas da via (SHH, PTCH1, SMO, GLI 1-3 e SUFU) quanto para seus alvos (BMP4, BCL-2 e CCND1). Todos os resultados serão submetidos à análise estatística. (AU)