Efeitos da radioterapia na neoformação óssea, osseointegração, tecidos circunjacentes e células mesenquimais

Resumo

Radioterapia é o procedimento no qual ocorre liberação de irradiação em áreas específicas, visando tratamento de tumores. Entretanto danos agudos ou crônicos podem desenvolver-se na área irradiada e nos tecidos normais circunjacentes. No tecido ósseo, as injurias variam desde osteopenia até osteroadionecrose e devido a estas alterações pacientes irradiados portadores de implantes vêm demonstrando maior taxa de insucesso. O objetivo neste estudo será avaliar os efeitos da radioterapia, simulando uma dose total de um tratamento radioterápico convencional para pacientes oncológicos, na neoformação óssea e na osseointegração de implantes em fêmures de ratos, nos tecidos moles circunjacentes à área irradiada, bem como na diferenciação e expressão gênica das células mesenquimais presentes nestes fêmures, além de avaliar o dano nuclear presente nestas células mesenquimais. Serão utilizados neste estudo 160 ratos que receberão implantes cilíndricos de titânio comercialmente puro (TiCp) nos fêmures direito e esquerdo. Os animais serão divididos em 4 grupos: a) Grupo implante (Ip): cirurgia de colocação dos implantes (grupo controle - tecido sadio sem irradiação); b) Grupo irradiação imediata (IrI): cirurgia de colocação dos implantes seguido de irradiação imediata; c) Grupo irradiação tardia (IrT): cirurgia de colocação dos implantes e irradiação após 4 semanas; d) Grupo irradiação (Ir): irradiação e após 4 semanas cirurgia de colocação dos implantes. Os animais dos grupos IrI, IrT e Ir serão submetidos a irradiação em etapa única na dose de 70 Gy. Os animais serão eutanasiados aleatoriamente nos períodos de 3 dias, 2 e 6 semanas após o tratamento. Durante o experimento, os animais serão cuidadosamente monitorados quanto as alterações clínicas como hábitos alimentares, perda de pêlos, infecção das feridas cirúrgicas e perda de peso. Serão também mensurados os níveis plasmáticos de IL-6 e TNF-± após 12 e 48 horas da radioterapia e no momento da eutanásia. Em cada período 08 animais serão submetidos à microtomografia computadorizada (µCT) e posterior análise histológica e histomorfométrica, visando avaliar a neoformação óssea e a interface osso-implante. Será realizada também a marcação imunohistoquímica do tecido ósseo e interface osso-implante utilizando os marcadores anti PARP p-85, TGF-² e VEGF. Os outros 08 animais, de cada período,excluindo o período de 3 dias, serão submetidos ao teste de push-out para avaliar a força de fixação osso-implante, obtida na osseointegração. No momento da eutanásia, em todos os animais, a pele circunjacente será removida, fixada e processada por meio da técnica histológica convencional HE e picrosirus red para avaliação respectivamente do grau de inflamação presente e do diâmetro das fibras colágenas. Adicionalmente será realizada marcação imunohistoquímica para anti PARP p-85, TGF-beta e VEGF no tecido cutâneo. No tecido muscular, previamente a eutanásia, será mensurada a atividade de contractibilidade do músculo presente na área cirúrgica utilizando um eletromiógrafo e após a eutanásia será avaliada a presença de fibrose muscular em lâminas coradas com tricrômio de Masson. A atividade e diferenciação das células mesenquimais presente nos fêmures, será avaliada por testes in vitro de viabilidade celular, conteúdo de proteína total, atividade de fosfatase alcalina, citoesqueleto celular e formação de nódulos de mineralização. O dano ao núcleo celular será verificado utilizando o teste de micronúcleos. A expressão gênica de marcadores como fosfatase alcalina, integrina beta1, colágeno 1, osteocalcina, osteopontina, osteonectina, sialoproteína óssea, TGF-beta, osterix, Runx2 e fator estimulador de colônias de macrófagos - MCS-F será avaliada nas células mesenquimais por RT-PCR Todos os dados serão estatisticamente analisados, inicialmente por meio do teste de normalidade visando a aplicação do teste estatístico adequado. O nível de significância adotado será o valor convencional de 5%. (AU)