Análise do potencial terapêutico da proteína recombinante humana RSPO1 na regeneração de intestino delgado em modelo animal utilizando tecnologias de engenharia tecidual

Resumo

Técnicas baseadas em engenharia tecidual e na capacidade regenerativa do intestino, representam uma grande oportunidade como potenciais terapias alternativas para a Síndrome do Intestino Curto (SIC). O desenvolvimento de unidades organoides isoladas e capazes de produzir todas as linhagens celulares epiteliais representou um passo importante, sendo que uma promessa ainda maior reside no uso de células-tronco para gerar um intestino delgado a partir de Engenharia Tecidual (TESI, do inglês Tissue-Engineered Small Intestine). Técnicas recentes utilizam arcabouços artificiais tridimensionais e biodegradáveis, sobre os quais as unidades organoides podem se desenvolver, criando um cenário bastante promissor no que diz respeito ao tratamento da SIC. Contudo, as unidades organoides em crescimento, são dependentes de uma grande quantidade de energia, nutrientes e fatores de crescimento para serem funcionais. Portanto, formas de otimizar este processo fazem-se necessárias para o sucesso nesse tipo de tratamento, e a proteína R-Espondina1 recombinante humana (rhRSPO1), dado o seu potencial proliferativo em células tronco intestinais, juntamente com outros fatores peptídicos, como os rhVEGFs, pode ser uma peça chave. As proteínas RSPO compõem uma família de proteínas secretadas conhecidas por seus papeis importantes na proliferação, diferenciação e morte celular, induzindo a via de Wnt. Atualmente, sabe-se que a via de WNT/²-catenina é importante para manter o epitélio intestinal, regulando o processo de auto-renovação, que ocorre no eixo vilosidade-cripta, através dos ligantes canônicos de WNT, que funcionam como mitógenos de células progenitoras da cripta. Dentre as RSPOs, a RSPO1 tem esta capacidade mitogênica no epitélio intestinal, com efeitos desprezíveis na maturação e migração de células diferenciadas ao longo do eixo vilosidade-cripta. Por este motivo, a RSPO1, destaca-se das demais no que diz respeito ao seu potencial uso terapêutico na área de Medicina Regenerativa para regeneração de intestino. Este potencial vem sendo confirmado por diversos estudos que tem evidenciado o uso de RSPO1 em modelos animais em casos de mucosite intestinal induzida por quimioterápicos e Doenças Inflamatórias Intestinais. Além disso, Lgr4, um dos receptores da família Lgr ao qual RSPO1 liga-se, é coexpresso com RSPO1 em células-tronco, sendo detectável em todas as outras células progenitoras, confirmando a hipótese de que RSPO1 seria capaz de induzir a proliferação nestas células. Outros estudos demonstraram, ainda, que as células-tronco intestinais Lgr5+ isoladas podem ser mantidas in vitro e induzidas à propagar organoides continuamente. Dessa forma, futuras tentativas de reconstituir o tecido epitelial danificado por doenças ao longo do trato gastrointestinal provavelmente vão explorar a expansão ex-vivo dos epitélios de interesse, mediada por RSPOs. Portanto, o trabalho aqui proposto tem, por objetivo, dar continuidade à colaboração previamente estabelecida com o grupo da Prof. Tracy C. Grikscheit, da University of Southern California em Los Angeles e do Saban Research Institute do Children's Hospital Los Angeles, Califórnia, EUA, pelo ex-aluno de Doutorado (Gustavo G. Belchior), que iniciou a análise da atividade biológica das isoformas de rhVEGF sobre a cultura de unidades organoides murinas, visando à formação do TESI. No presente trabalho, será testada a atividade biológica da rhRSPO1, que foi produzida a partir de clones celulares HEK293 e CHO-DG44 superprodutores e purificada em nosso laboratório, sobre a cultura de unidades organoides murinas e a formação do TESI, individualmente ou combinada aos VEGFs. A proteína rhRSPO1 já está sendo produzida em nosso laboratório nos dois sistemas celulares (HEK293 e CHO-DG44), com atividade biológica in vitro demonstrada e purificação em andamento. A otimização do processo de purificação da rhRSPO1, que está em curso, deve levar à uma rhRSPO1 altamente purificada para ser utilizada neste projeto. (AU)