Regulação pós-traducional de dicer mediada por estresse oxidativo: caracterização estrutural e funcional da interação 4-hne-dicer

Resumo

O aldeído 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) é um dos principais subprodutos da peroxidação lipídica, processo exacerbado sob condições de estresse oxidativo. Esse aldeído apresenta alta reatividade com biomoléculas, sendo capaz de formar ligações de alta afinidade (adutos) com proteínas, lipídios e DNA, as quais estão associadas à modificação da função e degradação de seus alvos, de modo que seu acúmulo tem sido correlacionado ao desenvolvimento de inúmeras doenças. Recentemente, nosso grupo identificou a formação de adutos entre 4-HNE e três resíduos da proteína DICER em coração de ratos com insuficiência cardíaca, enzima essencial na via de biogênese de microRNAs. Interessantemente, os resíduos identificados (K1324, H1325, K1339) estão localizados no domínio catalítico RNAse IIIA, próximos ao seu sítio ativo EXXXD1320. Visto que a deleção seletiva de DICER no coração desencadeia cardiomiopatia dilatada e insuficiência cardíaca em modelo animal, nós criamos a hipótese de que a interação 4-HNE-DICER poderia comprometer a atividade da proteína e promover disfunção cardíaca. Nesse projeto, nós planejamos avaliar o impacto individual de cada resíduo alvo do 4-HNE sobre a função de DICER, assim como o papel dessa interação na resposta celular ao estresse oxidativo. Nossos resultados preliminares em modelos celulares e animal demonstraram que a atividade de DICER é reduzida frente condições agudas e crônicas de estresse de aldeídos. Contudo, os mecanismos envolvidos nessa resposta ainda não estão claros. Tanto a interação entre o aldeído e DICER, quanto o efeito sobre a mesma não foram descritos na literatura. Em animais com disfunção cardíaca, a atividade de DICER apresentou redução de aproximadamente 47% no tecido cardíaco. Esse resultado foi acompanhado pela diminuição substancial na expressão de microRNAs maduros cardíacos (fitas 3p e 5p). Notavelmente, a ativação farmacológica da enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2), acompanhada pela redução nos níveis de 4-HNE, foi capaz de prevenir o prejuízo na função de DICER (~27%) nesses animais. Consistente com os achados in vivo, células da linhagem H9C2 tratadas com 4-HNE (50µM) apresentaram um aumento de 40% nos níveis de adutos do aldeído com proteínas, seguido de uma redução significativa de 32% na atividade de DICER. Contudo, ambos os modelos não nos permitiram demonstrar a relação de causa-efeito entre 4-HNE e o prejuízo na função de DICER. Nesse contexto, com o objetivo de confirmar a relação de causalidade e avaliar o efeito da modificação de cada resíduo previamente identificado, iremos produzir proteínas recombinantes (DICER wild type e mutantes) e testá-las em ensaios in vitro quanto a sua atividade e estabilidade na presença de 4-HNE. Também consideramos essencial a expressão de ambas as formas da proteína DICER, WT e mutantes, em células knockout para DICER (MEF Dicer -/-) a fim de avaliar o efeito biológico das modificações individuais dos resíduos em células expostas às condições de estresse oxidativo. Para tanto, nós iremos trabalhar em colaboração com o Prof. Dr. Ian J. MacRae do Scripps Research Institute, (CA-EUA) pesquisador referência em estudos de Biologia Estrutural de DICER e biogênese de microRNA com experiência nas estratégias mencionadas acima. (AU)