Análise da atividade e perfil de expressão da proteína dicer em condições de estresse de aldeídos: possível papel protetor da enzima ALDH2

Resumo

O estresse oxidativo está associado ao estabelecimento e progressão de diversas patologias. Além da sua ação direta sobre os constituintes celulares, as espécies reativas de oxigênio (EROs) são responsáveis pela geração de outras moléculas pró-oxidantes, como é o caso do aldeído 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE), produto da peroxidação lipídica. Esse aldeído apresenta alta reatividade com biomoléculas, sendo capaz de formar ligações de alta afinidade (adutos) com proteínas, lipídios e DNA, as quais estão associadas à modificação da função e degradação de seus alvos, de modo que seu acúmulo tem sido correlacionado ao desenvolvimento de inúmeras doenças como o câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. Experimentos preliminares do nosso laboratório utilizando ratos com insuficiência cardíaca (IC) identificaram um aumento significativo nos níveis de 4-HNE cardíaco, associado ao desenvolvimento da patologia. Adicionalmente, realizamos uma proteômica com o intuito de verificar quais proteínas cardíacas formavam adutos com o 4-HNE na IC. Dentre os resultados obtidos, foi identificada a formação de adutos de Michaelis entre 4-HNE e três resíduos da proteína DICER (K1324, H1325 e H1339). A DICER é uma endonuclease essencial na biogênese dos miRNAs, e consequentemente, na regulação gênica pós-transcricional. Trabalhos recentes demonstraram que a exposição ao estresse oxidativo reduz a expressão da DICER. Entretanto, os mecanismos envolvidos nesse processo, bem como sua contribuição na biogênese de miRNA, regulação gênica pós-transcricional e funcionamento celular ainda não foram elucidados. Nesse contexto, o objetivo do presente projeto de pesquisa é caracterizar o 4-HNE como agente regulador da DICER em condições de estresse oxidativo. Para isso, validaremos nossos achados iniciais de interação entre 4-HNE e DICER na IC. Além disso, caracterizaremos as consequências dessa interação na atividade e perfil de expressão da DICER em cultura celular (células HEK 293 e H9C2), em lisado tecidual, e in vivo utilizando o nematoide Caenorhabditis elegans que expressa constitutivamente o constructo DICER-GFP. Por fim, validaremos o potencial da ativação seletiva da enzima aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) na prevenção ou redução da interação 4-HNE-DICER. Vale ressaltar que a ALDH2 é a principal enzima envolvida na degradação do 4-HNE. No projeto, o estresse será induzido nas células e nos nematoides por Paraquat (gerador de ânion superóxido) ou 4-HNE. A atividade da DICER será avaliada de duas maneiras distintas: para os ensaios em cultura celular utilizaremos real time imaging em células HEK 293 modificadas (RNAi-293-EGFP/RFP); já no lisado celular ou tecidual utilizaremos um molecular Beacon específico para a DICER. O perfil de expressão da DICER será avaliado por qPCR e Immunoblotting no lisado celular ou tecidual; e por real time imaging nos nematoides através da fluorescência emitida pela DICER-GFP. Nossa hipótese é que o acúmulo de 4-HNE no estresse oxidativo prejudica diretamente a atividade e/ou perfil de expressão da DICER através do aduto 4-HNE-DICER. Nossos resultados preliminares são promissores, demonstrando que o tratamento com 4-HNE compromete a biogênese de siRNA em células HEK ao longo do tempo. Para esse projeto contaremos com a colaboração dos Profs. Marcelo Mori (UNIFESP), Mario Hirata (FCF-USP) e Daria Mochly-Rosen (Stanford University). (AU)