Ação de DNase produzida por Paracoccidioides Brasiliensis sobre NETs (neutrophil extracellular traps) liberadas por neutrófilos humanos em resposta ao fungo

Resumo

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica considerada endêmica na América Latina. Seus agentes etiológicos, fungos do complexo Paracoccidioides, podem ser classificados como fungos dimórficos, possuindo, assim como outros membros de sua família, habitat geográfico restrito, conídios como forma infectante e as mesmas características termo-dimórficas. A infecção acontece pela inalação dos conídios infectantes, levando a uma resposta imunológica grave nos pulmões, com formação de lesões granulomatosas e dependendo da forma clínica, disseminação para outros órgãos. Os neutrófilos, células da imunidade inata, são responsáveis por uma resposta de defesa importante, liberando redes que são chamadas de NETs (Neutrophil Extracellular Traps), e que possuem a capacidade de envolver e destruir as leveduras do fungo. Entretanto, já foi identificado que alguns fungos são capazes de produzir DNAse como um mecanismo de escape dessas redes. Como já foi identificado em trabalhos anteriores, diferentes padrões de NETs, quando neutrófilos humanos foram desafiados com diferentes cepas de Paracoccidioides brasiliensis, gostaríamos de avaliar se essa diferenciação na conformação das NETs estaria relacionada com a capacidade dessas cepas em produzirem DNAse, ou uma proteína "like", com atividade semelhante à DNAse, e que teria capacidade de degradar as NETs para garantir a sobrevivência do fungo. Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho será identificar nas culturas de neutrófilos humanos desafiados com as cepas Pb18 (virulenta) e Pb265 (avirulenta), a produção, liberação e os diferentes padrões de NETs em resposta às diferentes cepas do fungo, correlacionando com a capacidade dessas cepas em produzirem DNAse nessas culturas. Para isso, neutrófilos de sangue periférico de 15 indivíduos saudáveis serão isolados e desafiados in vitro com ambas as cepas do fungo, cultivados e replicados em nosso laboratório. A produção, liberação e conformação de NETs em resposta ao fungo serão avaliadas por Microscopia Confocal, de Varredura, e por técnica de High Content, e a quantificação de NETS será realizada utilizando o kit fluorimétrico Quant-iT PicoGreen. A quantificação da expressão de RNA do gene codificante da DNAse fúngica será realizada por RT-PCR. (AU)