Identificação e purificação de DNAse produzida por fungos do complexo de espécies Paracoccidioides spp e sua ação sobre NETS (Neutrophil Extracellular Traps) liberadas por neutrófilos humanos em resposta ao fungo

Resumo

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica cujos agentes etiológicos são os fungos das espécies S1 (Paracoccidioides brasiliensis), PS2 (Paracoccidioides americana), PS3 (Paracoccidioides restrepiensis), PS4 (Paracoccidioides venezuelensis) e o Paracoccidioides lutzii, todos pertencentes ao complexo de espécies Paracoccidioides spp. Sendo uma doença endêmica nos países da América Latina, sua distribuição se mostra heterogênea e com os maiores focos se concentrando em alguns países como Brasil, Venezuela e Colômbia. Estudos evolutivos moleculares recentes sugerem mecanismos diversificadores de patogenicidade e sobrevivência intracelular em todas as espécies de Paracoccidioides, demonstrando que o gênero Paracoccidioides apresenta diferenças importantes em seus perfis metabólicos, o que deve desempenhar um papel crítico durante a interação hospedeiro-patógeno. Os neutrófilos, células da imunidade inata, são responsáveis por desempenhar uma resposta de defesa importante, liberando redes extracelulares de DNA complexada à diferentes enzimas, que são chamadas de NETs (Neutrophil Extracellular Traps), e que possuem a capacidade de envolver e destruir as leveduras do fungo. Entretanto, já foi identificado que alguns fungos são capazes de produzir DNAse como um mecanismo de escape dessas redes. Sendo a produção de DNAse extracelular um importante fator de virulência já demonstrado para diversos microrganismos, o presente estudo terá como objetivos a avaliação da produção de DNAse por diferentes cepas de fungos do complexo de espécies Paracoccidioides spp. Além disso, como já foi identificado em trabalhos anteriores, diferentes padrões de NETs, quando neutrófilos humanos foram desafiados com diferentes cepas de Paracoccidioides brasiliensis, gostaríamos também de avaliar se essa diferenciação na conformação das NETs estaria relacionada com a capacidade dessas cepas produzirem a enzima, ou uma proteína "like", com capacidade de degradar as NETs, e dessa forma garantir a sobrevivência do fungo. Para tal, utilizaremos dois delineamentos experimentais, em que primeiramente, diferentes espécies do gênero Paracoccidioides serão avaliadas e a atividade da DNAse produzida nessas culturas fúngicas serão visualizadas em placas de DNase Test Agar. As enzimas das culturas serão também extraídas, identificadas e quantificadas utilizando técnicas de HPLC e Espectrometria de Massa, e a expressão gênica da DNAse será analisada pela técnica de RT-PCR. Também avaliaremos essa produção enzimática durante a interação dos fungos com os neutrófilos humanos in vitro, avaliando-se a produção, liberação e os diferentes padrões de NETs em resposta às diferentes cepas do fungo, correlacionando com a capacidade dessas cepas em produzirem DNAse nessas culturas. Assim, utilizaremos técnicas de Microscopia Confocal, de Varredura, e técnica de High Content, para avaliação da liberação e conformação das redes, e a quantificação de NETS será realizada utilizando o kit fluorimétrico Quant-iT PicoGreen. A quantificação da expressão de RNA do gene codificante da DNAse fúngica será realizada por RT-PCR em tempo real. (AU)