Efeitos da leptina no metabolismo e diferenciação de linfócitos

Resumo

Na Obesidade, ocorre aumento de leptina no plasma e polarização de linfócitos para células Th1 acompanhada de inibição das células T reguladoras (Treg). Entretanto, não está estabelecida a relação entre as concentrações de leptina e a diferenciação de linfócitos em humanos. O fluxo de metabólitos pela via glicolítica correlaciona-se com a diferenciação das células Th0 para Th1 e Th17, que apresentam atividade inflamatória. A inibição da via glicolítica bloqueia este processo e promove diferenciação para células Treg. Nossa hipótese é de que, nas concentrações plasmáticas encontradas em pacientes obesos, a leptina estimula a polarização de linfócitos para o perfil Th1 e Th17, processo acompanhado por aumento na atividade da via glicolítica. O efeito de diferentes concentrações de leptina (5, 10, 25, 40, 50, 100 e 200 ng/mL) no meio de cultura será avaliado no processo de diferenciação e metabolismo de linfócitos obtidos de voluntários magros (protocolo 1). Experimentos serão também realizados em linfócitos obtidos de indivíduos obesos e os dados comparados com aqueles de sujeitos magros (protocolo 2). No protocolo 1, os linfócitos serão isolados do sangue venoso de homens saudáveis e eutróficos com idade entre 18 e 40 anos. Posteriormente, os linfócitos serão tratados com 5 a 200 ng/mL de leptina por 24 horas, e em seguida estímulados com acetato miristato de forbol (PMA) e ionomicina por 12 horas ou com fito hemaglutinina (PHA) por 48 horas. Paralelamente, avaliaremos os mesmos parâmetros em linfócitos obtidos do sangue de indivíduos obesos e magros, sem serem cultivados (protocolo 2). Os resultados obtidos no protocolo 2 serão correlacionados com a concentração plasmática de leptina dos voluntários e os dados obtidos no protocolo 1 com a curva dose resposta obtida. Os seguintes parâmetros serão avaliados: teste de integridade de membrana e fragmentação de DNA por incorporação de iodeto de propídio; perfil de resposta Th1, Th2 e Th17; expressão de GLUT1 e do receptor de leptina na membrana plasmática; capacidade proliferativa por incorporação de BRDU por citometria de fluxo; fosforilação e expressão total de proteínas envolvidas na sinalização à leptina (JAK2, STAT3, ERK1/2, Akt e p38) e análise da expressão dos complexos protéicos da cadeia de transporte de elétrons (I a IV) por western blotting; expressão do mRNA das enzimas envolvidas com a beta oxidação por PCR em tempo-real; produção de lactato e atividade da hexoquinase, citrato sintase, glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e piruvato desidrogenase por espectrofotometria; potencial transmembrana da mitocôndria por citometria de fluxo; ensaio de oxidação de [U-14C] palmitato a CO2 e cinética do consumo de O2 no oxígrafo. As mesmas análises serão realizadas na presença dos antagonistas das vias de sinalização ativadas por leptina: JAK2/STAT3, p38MAPK e ERK1/2. O presente estudo possibilitará determinar os efeitos de diferentes concentrações de leptina no processo de diferenciação de linfócitos que podem estar relacionados com o perfil inflamatório dos linfócitos observado em indivíduos obesos. (AU)