Consequências funcionais de truncamentos no gene Fbxl17 na estabilidade e atividade da E3 ubiquitina ligase SCF(Fbxl17)

Resumo

A Fbxl17 é uma das 69 proteínas do tipo F-box em humanos capazes de formar um complexo E3 ubiquitina ligase chamado SCF(Fbxl17) com outras três proteínas, SKP1, Cullin1 e RBX1. Este complexo é responsável pela ubiquitinação dos substratos recrutados pela proteína Fbxl17 através de seu domínio LRR (Leucine Rich Repeat - uma sequencia rica em leucina). Em um estudo colaborativo com a University of Cambridge/UK, nosso grupo identificou mutações no gene FBXL17 que geram truncamentos no domínio LRR em 135 de 1992 amostras de pacientes do projeto METABRIC (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium). Além disso, CGH-array (Comparative Genomic Hybridization) de 746 l_cancerosas mostrou que FBXL17 apresentou quebra em 3 linhagens de câncer de mama, BT-474, HCC38 e HCC1395 e 1 de câncer esofágico/gástrico OE-19 que levou a formação de versões de Fbxl17 com truncamentos no seu domínio LRR, mais frequentemente 3xLRR (denominado aqui ”3LRR). Por afetar um domínio de interação com seus substratos, estes truncamentos podem afetar a interação Fbxl17-substrato e consequentemente gerar um desequilíbrio das formas dos substratos ubiquitinadas e não ubiquitinados alterando a homeostase celular. No entanto, nenhum estudo até o momento avaliou as consequências funcionais deste truncamento na função da E3 ubiquitina ligase SCF(Fbxl17). Sendo assim, este projeto tem o objetivo de avaliar a estabilidade e atividade in vitro dos complexos SCF(Fbxl17-”3LRR) em comparação aos complexos selvagens SCF(Fbxl17). Para isso, estes complexos serão imunoprecipitados de células HEK293T e MCF7 e avaliaremos por western blot a copurificação de Fbxl17 e Fbxl17-”3LRR com os demais componentes do complexo, SKP1, Cullin1 e RBX1. Além disso, experimentos de ubiquitinação in vitro serão realizados para inferirmos sobre a funcionalidade destes complexos. Esperamos com este projeto contribuir para o entendimento das consequências funcionais dos truncamentos no gene FBXL17 presentes em amostras de pacientes com câncer de mama.