Desenvolvimento do processo de purificação da pneumolisina recombinante geneticamente destoxificada obtida em Escherichia coli

Resumo

A bactéria Streptococcus pneumoniae é um importante patógeno humano que causa doenças graves, com elevadas taxas de mortalidade. As vacinas pneumocócicas atuais têm como base os polissacarídeos capsulares, mas seu custo de produção é elevado e sua cobertura é limitada aos sorotipos incluídos na formulação. Assim, vacinas proteicas têm sido propostas como alternativa. Dentre os candidatos estudados destaca-se a pneumolisina (Ply), toxina hemolítica que se liga ao colesterol da membrana, oligomerizando-se e gerando poros que lisam as células do hospedeiro. Ply também liga-se ao toll-like receptor 4, desencadeia a ativação do complemento pela via clássica independente de anticorpos e, recentemente foi demonstrado que os poros formados ativam o inflamassoma NLRP3. Portanto, Ply tem grande potencial vacinal e imunomodulador, por isso, devido à sua toxicidade, foi geneticamente destoxificada para emprego em vacinas. Este projeto propõe estabelecer o processo de purificação da proteína recombinante destoxificada (PdT) para que possa futuramente ser avaliada para formulação de uma nova vacina pneumocócica baseada em nanopartículas para administração em pó. PdT foi clonada em Escherichia coli sem qualquer tag de afinidade para evitar as caras e relativamente ineficientes etapas de remoção da tag. O cultivo será feito em biorreator com meio de autoindução livre de compostos de origem animal, com as especificações de produção já obtidas em processos anteriores, para produção da PdT. Para o processo de purificação as seguintes etapas serão avaliadas: remoção de debris e impurezas do lisado, cromatografia de troca aniônica e de interação hidrofóbica, concentração/diafiltração para acondicionamento. Dependendo dos resultados, diferentes esquemas de purificação serão investigados: troca catiônica, gel filtração ou interação mista. Uma vez estabelecido o processo de purificação, cultivo e purificação serão analisados integradamente a fim de definir o processo geral com maiores recuperação e pureza.