Produção de uma cistatina de cana-de-açúcar em Nicotiana benthamiana

Resumo

Fitocistatinas são inibidores de cisteíno peptidases do tipo tight binding produzidos por plantas. Além de apresentarem motivos conservados presentes em todas as cistatinas, as fitocistatinas apresentam a sequência N-terminal L-A-R-F-A-V-X (3)-N enovelada em forma de ±-hélice. Até o presente momento, o Laboratório de Biologia Molecular descobriu, produziu heterologamente e caracterizou 6 fitocistatinas de cana-de-açúcar nomeadas CaneCPI-1 a CaneCPI-6. Destas, a CaneCPI-5 já se mostrou eficiente na proteção contra erosão do esmalte do dente e atualmente está em fase de licenciamento de patente para tal uso. No entanto, a quantidade de proteína obtida tanto por meio de expressão em Escherichia coli quanto Pichia pastoris ainda é baixo para uso industrial. Assim, a produção de proteínas em plantas é o sistema mais adequado para o escalonamento desta proteína. A transformação transiente em Nicotiana benthamiana é um método rápido de produção de proteínas recombinantes através da introdução de agrobactérias geneticamente modificadas em folhas. A proteína de interesse é obtida após apenas alguns dias, extraída e purificada do tecido infiltrado. Portanto, o presente projeto tem como objetivo produzir CaneCPI-5 em Nicotiana benthamiana por transformação transiente e, paralelamente, a transformação de suspensão de células BY-2 como segunda opção para produção da proteína. Após confirmação da produção da proteína, CaneCPI-5 será purificada usando coluna de bioafinidade com níquel e a sua atividade será medida por ensaios fluorimétricos medindo a clivagem do substrato Z-Phe-Arg-AMC na presença da papaína (cisteíno peptidase). Finalizando, este projeto emprega os métodos mais avançados de molecular farming para produção de uma proteína com alto valor comercial.