Construção de um biossensor ultrassensível de diagnóstico baseado no sistema CRISPR-Cas12 para detecção de SARS-CoV-2 e variantes sem amplificação de ácidos nucleicos

Resumo

A metodologia de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) tornou-se uma tecnologia diagnóstica de referência para várias infecções, inclusive na atual pandemia de COVID-19. Contudo, a dependência de equipamentos especializados e de pessoal altamente treinado restringe a utilização desse método a laboratórios centralizados. Métodos alternativos de amplificação e detecção de ácidos nucléicos, baseados em tecnologias de amplificação isotérmica (tais como LAMP, NASBA e RPA), têm surgido nos anos recentes como alternativas para descentralização dos métodos diagnósticos baseados em amplificação e detecção de ácidos nucléicos, mas a detecção específica dos produtos amplificados ainda representa um desafio à essas metodologias. Técnicas de diagnóstico baseados em CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas), buscam alcançar os requisitos mínimos para serem usando no ponto de atendimento do paciente. Por outro lado, os diagnósticos baseados em CRISPR (CRISPR-Dx) ainda dependem de métodos de amplificação de DNA ou possuem uma baixa sensibilidade, o que impede a aplicação desses testes no mundo real. Diante disto, esse projeto tem como objetivo desenvolver uma nova tecnologia biossensora baseada em CRISPR-Cas12, combinando diferentes estratégias para aumentar a sensibilidade da reação sem a necessidade de amplificação de DNA. Essa estratégia busca aprimorar o sinal de três maneiras: 1) o uso de nanopartículas de ouro para amplificar o sinal fluorescente emitido em decorrência da clivagem colateral dos substratos fluorescentes; 2) aplicar microesferas magnéticas com alta capacidade de ligação e distribuição desses alvos; 3) o uso de múltiplos sgRNA que serão direcionados a diferentes fragmentos do mesmo alvo, para aumentar a sensibilidade de reconhecimento do alvo. Assim, espera-se que tal teste seja mais sensível e tenha um limite de detecção menor do que os testes já desenvolvidos até o momento. Também é previsto que esse teste tenha alta acurácia quando comparado ao PCR em tempo real.