Investigando os mecanismos upstream de ativação da proteína quinase C de A. fumigatus como uma estratégia para a inibição da via da integridade da parede celular e busca de novas abordagens antifúngicas

Resumo

A parede celular é essencial para a sobrevivência da célula fúngica, exercendo proteção contra o dano osmótico, além de ser um componente de reconhecimento pelo sistema imune do hospedeiro mamífero durante o curso de infecção por patógenos fúngicos. A compreensão dos mecanismos de como a célula fúngica constrói e remodela a parede celular mediante condições de estresse é de grande relevância face às altas taxas de morbimortalidade causadas por estes agentes patogênicos, incluindo o fungo filamentoso Aspergillus fumigatus. O nosso laboratório tem concentrado esforços na investigação de uma das vias de transdução do sinal, responsáveis pela síntese de parede celular em fungos, a via da integridade da parede celular (CWI). Nossos dados têm indicado que o funcionamento da CWI inicia-se com a ativação da proteína quinase C (PKC) apical (PkcA), um evento crucial para a subsequente ativação cascata MAPK downstream e do principal fator de transcrição associado à CWI, RlmA. Rho-GTPases são componentes importantes na ativação das PKCs, pois conectam a detecção do sinal extracelular ao estímulo da via pela interação física com a PKC. Porém, as evidências diretas da ativação da CWI por Rho-GTPases são esparsas em A. fumigatus, possivelmente devido à redundância dessas proteínas e ausência da noção da hierarquia de importância destas proteínas. Consequentemente, qual ou quais dos domínios de PkcA (C1 e HR1) estão envolvidos na ligação com Rho-GTPases não são conhecidos em A. fumigatus ou qualquer outro fungo filamentoso. PKCs como a PkcA têm um mecanismo complexo e multimodular de ativação e a conversão da forma inativa da enzima na forma ativa pode ser dependente de mensageiros secundários como o DAG (diacilglicerol), dependendo da classe da enzima. Entretanto, a ligação de DAG em PKCs fúngicas ainda é controversa e conclusões sobre a incapacidade dessas enzimas fúngicas de ligarem DAG no domínio regulatório C1B foram sugeridas apenas a partir de predições de alinhamentos da sequência primária e sem evidências experimentais. A lacuna do conhecimento sobre os mecanismos de ativação desta importante via de sinalização em fungos é a principal premissa deste projeto e dos experimentos associados a ela. Assim, esta proposta visa: (i) explorar a relevância dos domínios regulatórios C1 e HR1 de PkcA na ligação com Rho-GTPases; (ii) esclarecer a dependência ou não de PkcA de mensageiros secundários como o DAG para a sua ativação e função; (iii) validar um possível novo motif de ligação de RlmA como output da via CWI. Conjuntamente, os resultados irão gerar informações inéditas sobre os eventos iniciais de ativação da CWI em A. fumigatus e consequentemente sobre a biologia de fungos filamentosos. A identificação dos mecanismos associadas e proteínas envolvidas nesta via de sinalização pode fornecer oportunidades para o desenvolvimento de novas abordagens na busca de moléculas ativas. (AU)