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Estudo dos sistemas toxina-antitoxina VapBC de Leptospira interrogans: bioquímica, função e participação na fisiologia do estresse bacteriano

Processo: 18/05823-9
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de maio de 2019 - 30 de abril de 2021
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Bioquímica de Microorganismos
Pesquisador responsável:Alexandre Paulo Yague Lopes
Beneficiário:Alexandre Paulo Yague Lopes
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Pesq. associados:Ana Lucia Tabet Oller Do Nascimento
Assunto(s):Leptospira  Leptospira interrogans  Sistemas toxina-antitoxina  Óperon  VapBC  Virulência  Clonagem  Expressão gênica 

Resumo

Leptospira interrogans é um dos agentes causadores da leptospirose humana. Os operons Toxina-Antitoxina (TA) são amplamente distribuídos entre bactérias e codificam uma toxina estável e uma antitoxina instável. Sua função geral permanece controversa, mas a ação fisiológica do sistema TA é a suspensão reversível do crescimento celular sob condições de estresse. Integrantes destes sistemas têm sido relacionados à virulência de diversas bactérias durante a infecção, inclusive em L. interrogans (Komi et al., 2015). Os sistemas TA são classificados em tipos e famílias sendo que as Proteínas Associadas à Virulência B e C (VapBC) constituem a principal família TA, agrupada devido à homologia de um domínio PIN da toxina que atua como ribonuclease. O bando de dados "TA Data Base" (TADB) mostra que a L. interrogans serovar Copenhageni possui quatro loci vapBC, todos no cromossomo I. Previamente publicamos a caracterização bioquímica e funcional do primeiro membro descrito da família VapBC em leptospira que corresponde ao locus vapBC-3 (Lopes et al., 2014). Este projeto prevê a caracterização dos demais módulos VapBC com a clonagem e expressão dos operons vapBC 1, 2 e 4 em E. coli; purificação das proteínas recombinantes; caracterização da funcionalidade dos operons através da determinação da atividade tóxica e antitóxica sobre o crescimento de E. coli; reconhecimento (Western blotting) em diferentes linhagens de leptospira; avaliação de reatividade imunológica cruzada entre as toxinas e antitoxinas; teste de afinidade in vitro entre toxina e antitoxina ("ligand affinity blotting") e detecção diferencial de VapB e C (Western blotting) em leptospiras sob condições de estresse. Finalmente, este trabalho pretende elucidar se os módulos VapBC são funcionais e contribuir no estudo do seu papel na fisiologia do estresse bacteriano e levar a estudos futuros de sua função na patogenicidade da bactéria. (AU)