Síntese periplásmica e purificação do antagonista de prolactina humana Delta 1-11-G129R-hPRL

• Processo: 21/05368-2
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2021
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Paolo Bartolini
• Beneficiário: Paolo Bartolini
• Instituição Sede: Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Secretaria de Desenvolvimento Econômico (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Antagonistic properties | DsbA signal peptide | Periplasmic Expression | Prolactin antagonist | Síntese de hormônios hipofisários

Resumo

O antagonista de prolactina ”1-11-G129R-hPRL é uma proteina recombinante de 21.9 kDa com 188 aminoácidos que inibe a proliferação de uma variedade de células que expressam os receptores de prolactina. A expressão periplásmica de proteínas recombinantes em E. coli é considerada uma opção para obter uma proteína solúvel e corretamente enovelada, como alternativa á produção citoplasmática. A meta deste trabalho foi portanto a síntese, pela primeira vez, do antagonista ”1-11-G129R-hPRL, testando diferentes temperaturas de ativação e purificando-o através de técnicas cromatográficas clássicas. A cepa de E. coli BL21 (DE3) foi transformada com um plasmídeo baseado no vetor pET25b( +), na sequencia sinalizadora DsbA e a sequencia de cDNA do próprio antagonista. Doses diferentes de IPTG foram adicionadas, ativando em diferentes temperaturas e extraindo o fluido periplásmico mediante shock osmótico. As condições melhores foram encontradas ativando a 35 °C durante 5 h e usando 0.4 mM IPTG, o que proporcionou uma expressão específica de 0.157 ± 0.015 ¼g/mL/A600 com uma densidade óptica final de 3.43 ± 0.13 A600. A purificaçao foi realizada mediante cromatografia de afinidade ao níckel, seguida de cromatografia de exclusão molecular (HPSEC), a quantificação sendo realizada mediante HPSEC. O antagonista de prolactina foi caracterizado mediante SDS-PAGE, Western blotting, HPLC em fase reversa (RP-HPLC) e MALDI-TOF-MS. O produto final apresentou > 95% de pureza e seus efeitos antagonistas foram avaliados in vitro, visando potenciais aplicações clínicas que incluem a inibição da proliferação de células de câncer que super expressam o receptor de prolactina e específicas propriedades anti-diabéticas, considerando também que o presente antagonista foi obtido em forma solúvel, corretamente enovelado e sem metionina inicial. (AU)