Efeito da substancia p, somatostatina e glucorticoide sobre a expressao de metaloproteinases por celulas derivadas de fibroblastos gengivais e do ligamento periodontal.

• Processo: 03/00499-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2003
• Data de Término da vigência: 28 de fevereiro de 2006
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Odontologia - Periodontia
• Pesquisador responsável: Ney Soares de Araujo
• Beneficiário: Ney Soares de Araujo
• Instituição Sede: Faculdade de Odontologia (FO). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Zimografia Biologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia Molecular | Cultura De Celula | Pcr-Rt | Western-Blotting | Zimografia

Resumo

O estresse pode alterar o início e progressão das doenças periodontais, entretanto, os mecanismos pelos quais isso acontece não são bem entendidos. Diante do importante papel das metaloproteinases (MMPs) na destruição periodontal e da presença de substâncias relacionadas ao estresse, como glucocorticóide e substância P e de indicadores da presença de somatostatina no periodonto, o objetivo do presente estudo é testar a hipótese de que glucocorticóide, substância P e somatostatina podem estimular a expressão de RNAm (ácido ribonucléico-mensageiro) codificador de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 e MMP-11 e, assim, a produção dessas enzimas, por células derivadas de fibroblastos do ligamento periodontal e de fibroblastos gengivais humanos normais. Um segundo objetivo é testar a atividade enzimática dessas MMPs. Células derivadas de fibroblastos humanos gengivais e do ligamento periodontal derivados de indivíduos sistemicamente saudáveis e sem doenças periodontais serão obtidos no momento de exodontias de pré-molares extraídos por indicação ortodôntica. Serão utilizadas para os experimentos as células entre a 4° e a 8° passagem. Os experimentos serão realizados em triplicata. Ao meio de cultura celular (DMEM) serão acrescidos: substância P em concentrações de 10-4 a 10-9 M; somatostatina, em concentrações a serem determinadas; corticosteróide em concentrações a serem testadas; e combinações destas substâncias. A detecção de RNAm codificador de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7 e MMP-11 será feita pela transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Primeiramente, o RNA total de cada grupo será obtido por meio de um kit de extração. Após a obtenção do RNA, será realizada a síntese de DNA complementar (cDNA). Pares de iniciadores para MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-11 serão obtidos da literatura. Os produtos das reações de PCR serão avaliados em gel de poliacrilamida a 6%. Em seguida, o gel será corado pela prata, escaneado e analisado. Para a detecção, identificação e quantificação das enzimas, MMPs 1, 2, 3, 7, e 11, a técnica de Western-Blotting será empregada, segundo protocolo pré-estabelecido. Adicionalmente, com o objetivo de se analisar a atividade enzimática dessas MMPs, a técnica da zimografia será empregada. Os dados serão expressos como média e desvio padrão e serão analisados por teste paramétrico (ANOVA), não-paramétrico. (AU)