Otimizacao da producao de glicerol quinase de recombinante da levedura pichia pastoris.

• Processo: 08/53661-6
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2008
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2010
• Área do conhecimento: Ciências Agrárias - Ciência e Tecnologia de Alimentos - Ciência de Alimentos
• Pesquisador responsável: Edwil Aparecida de Lucca Gattas
• Beneficiário: Edwil Aparecida de Lucca Gattas
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCFAR). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
• Assunto(s): Pichia pastoris Otimização de processo Glicerol quinase Indução
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Fermaentacao | Glicerol Quinase | Inducao | Otimizacao De Processo | Pichia Pastoris | Proteinas Heterologas

Resumo

O método enzimático mais direto para a dosagem do glicerol consiste na reação de fosforilação do glicerol pela glicerol quinase, GK (ATP: glicerol fosfotransferase, EC 2.7.1.30) seguida da oxidação do glicerol fosfato pela glicerol fosfato desidrogenase, GPDH (sn-glicerol-3-:NAD+ 2 oxiredutase, EC 1.1.1.8) com geração de NADH. O presente trabalho baseia-se em estudos de indução da enzima glicerol quinase da levedura Pichia pastoris geneticamente desenhada para produzir a enzima extracelularmente no meio de cultura. O deslocamento do equilíbrio de reação para a leitura da concentração do NADH gerado, correspondente a concentração do glicerol consumido, dependerá da expressão de altas quantidades das enzimas envolvidas. A seleção de mutante de Pichia pastoris, capaz de produzir alta concentração da GPDH no meio, sob indução, está sendo realizada em outro estudo e estamos conseguindo cerca de 0,4 m/L desta enzima. Um vetor integrativo pGAPZa (Invitrogen) contendo o gene GUT1 da glicerol quinase foi clonado e vem permitindo a expressão da fração constitutiva desta enzima, em clones da levedura Pichia pastoris. Estudos de indução da glicerol quinase, produzida em fermentador, serão realizados em diferentes composições de meios de cultura e com suplementação de oxigênio no crescimento da levedura. Com base na Metodologia das Superfícies de Resposta, serão realizados estudos estatísticos de otimização (i) das condições de crescimento da levedura e (ii) da atividade da glicerol quinase extracelular, em função da composição do meio de cultura, da suplementação de oxigênio, do pH do meio, da temperatura e tempo de crescimento. Através da utilização de delineamentos experimentais adequados será possível estudar o efeito das variáveis significativas na atividade fisiológica da levedura e na atividade enzimática extracelular, de modo a modelar e otimizar as condições do processo. (AU)

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