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Caracterização Funcional e Estrutural de Fosfolipases A2 Ácidas Tóxicas e Não-Tóxicas de Venenos de Serpentes

Processo: 07/01433-7
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de abril de 2009 - 31 de março de 2011
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
Pesquisador responsável:Andreimar Martins Soares
Beneficiário:Andreimar Martins Soares
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Bolsa(s) vinculada(s):09/05226-1 - Caracterização Funcional de Fosfolipases A2 Ácidas Tóxicas e Não-Tóxicas de Venenos de Serpentes, BP.TT
Assunto(s):Expressão de proteínas  Venenos de serpentes  Bothrops  Cristalografia de proteínas 

Resumo

Os venenos de serpentes do gênero Bothrops são ricos em fosfolipases A2 (PLA2s). As PLA2s básicas miotóxicas têm sido subdivididas em dois subgrupos: as proteínas Asp49, cataliticamente ativas usando Ca2+ como cofator; e as Lys49, inativas sobre substratos artificiais. A ausência de atividade catalítica não afeta a miotoxicidade. Por outro lado, as PLA2s ácidas presentes nos venenos de serpentes deste gênero foram pouco estudadas e pouco se sabe sobre o mecanismo de ação destas enzimas. Estas enzimas ácidas isoladas de venenos botrópicos, geralmente, não apresentam toxicidade experimental, mas, induzem importantes efeitos farmacológicos como inflamação, inibição da agregação plaquetária e hipotensão arterial. Mais recentemente, algumas enzimas ácidas demonstraram induzir efeito miotóxico e citotóxico, portanto, resolvemos investigar qual seria os possíveis resíduos de aminoácidos e/ou domínio estrutural envolvidos com estas atividades. As PLA2s ácidas de venenos de serpentes ainda não foram claramente caracterizadas do ponto de vista da relação estrutura-função, fazendo com que nos últimos anos aumentasse o interesse sobre seus estudos. O projeto propõe estudos bioquímicos, farmacológicos e estruturais comparativos entre as fosfolipases A2 ácidas tóxicas e não-tóxicas isoladas, recentemente em nosso laboratório, de venenos de serpentes na tentativa de melhor compreender o(s) possível(eis) mecanismo(s) de ação(ões) destas enzimas na miotoxicidade e citotoxicidade. Dentro deste contexto, este projeto propõe uma análise funcional e estrutural comparativa das PLA2s ácidas tóxicas e não-tóxicas isoladas dos venenos de Bothrops moojeni (BmooTX-I, PLA2 ácida tóxica e Bmoo-I-PLA2, não-tóxica), B. (n.) pauloenis (BpPLA2 ácida tóxica) e B. pirajai (BpirPLA2 ácida não-tóxica), avaliando: (i)- Isolar e caracterizar bioquimicamente estas PLA2s ácidas nativas diretamente do veneno; (ii)- Clonar e sequenciar os cDNAs das PLA2s ácidas, e expressar uma específica de B. moojeni (recPLA2); (iii)- Análise comparativa das propriedades tóxicas e farmacológicas das enzimas ácidas tóxicas e não-tóxicas nativas e recombinante; (iv)- O efeito citotóxico será avaliado sobre linhagens específicas de miotúbulos de músculo esquelético; e (v)- Estudos da relação estrutura-função serão realizados por meio de: 1-Sequenciamento completo das estruturas primárias das PLA2s; 2-Síntese química de peptídeos das regiões N- e C-terminais; 3-Modificações químicas de aminoácidos específicos, e 4-Tentativa de elucidação da estrutura tridimensional destas diferentes proteínas por técnicas de cristalografia de raios X e modelagem molecular. Desta forma, este projeto permitirá a possível tentativa de melhor compreensão do mecanismo de ação das PLA2s ácidas sobre a toxicidade, podendo colaborar para a geração de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. (AU)