Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial

• Processo: 97/06160-5
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 1997
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2001
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Célia Harumi Tengan
• Beneficiário: Célia Harumi Tengan
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Auxílio(s) vinculado(s): 99/06516-0 - Relationship of nadph diaphorase activity and type iii mitric oxide synthase expression in skeletal muscle of patients with mitocondrial disorders., AR.EXT
• Bolsa(s) vinculada(s): 00/06569-5 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.TT; 99/01527-3 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.TT; 97/10423-1 - Mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNA mitocondrial, BP.JP
• Assunto(s): DNA mitocondrial Senescência celular Radicais livres
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Delecao | Dna Mitocondrial | Duplicacao | Envelhecimento | Mitocondria | Radicais Livres
• Publicação FAPESP: https://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_176_149_150.pdf

Resumo

A principal alteração detectada em pacientes com uma doença mitocondrial é a deleção do DNAmt. A gênese desse rearranjo ainda não está esclarecida. Acredita-se que seja originada de recombinação anômala durante a replicação, favorecida por repetições diretas ou outras alterações, como sequências palindrômicas, genes de RNAt, alterações conformacionais por alta tensão helicoidal e radicais livres. Devido ao aparecimento de dois rearranjos (duplicação e deleção) num mesmo paciente, foi sugerido que o DNAmt duplicado seria um precursor do DNAmt deletado. No entanto, a real frequência da duplicação em pacientes com deleção do DNAmt ainda não está definida. As deleções podem ser encontradas, também, no envelhecimento normal, e sugere-se que seu aparecimento esteja relacionado à lesão por radicais livres provenientes da cadeia respiratória mitocondrial. Porém, em estudo anterior, verificou-se que pacientes com deficiência na cadeia respiratória, que teoricamente geraria mais radicais livres, não acumulam essa deleção de forma mais acelerada. O objetivo deste projeto é tentar elucidar os mecanismos envolvidos na gênese dos rearranjos do DNAmt. Na primeira parte do trabalho, será analisada a presença de duplicação em pacientes com deleções do DNAmt por meio de Southern blotting e sequenciamento, e será realizada correlação genotípico-fenotípica. Na se gunda parte, se tentará melhorar a técnica do PCR longo para o diagnóstico de deleções do DNAmt em pacientes, o que facilitará o diagnóstico devido à facilidade técnica, à rapidez e não à necessidade de material radioativo. Na terceira parte, pretende-se verificar se pacientes com defeito na fosforilação oxidativa apresentam maior produção de radicais livres por meio de imunoistoquímica e Western blot de material proveniente de músculo, utilizando-se anticorpos contra SOD (Superoxido Dismutase) e NOS (Nitric Oxide Syntethase). Na quarta parte, será verificado o cérebro de ratos epilépticos (modelo experimental da pilocarpina) que apresentem aumento de SOD e NOS na fase aguda. Será analisada a presença de deleções do DNAmt (uma deleção específica pelo método quantitativo de diluições de múltiplas deleções pelo método de PCR longo) e proteínas mitocondriais (COX II e COX IV) por meio de imunoistoquímica e Western blot. Este estudo será realizado na fase crônica do modelo, ou seja, após três meses de indução do status epilético. Os resultados deste projeto poderão contribuir para o conhecimento da relação entre a duplicação e deleção do DNAmt, simplificar o diagnóstico das deleções do DNAmt e verificar se as deleções do DNAmt no envelhecimento realmente estão associadas com a lesão oxidativa. (AU)