Producao anticorpos monoclonais para a deteccao de um proteinase acida secreta de candida spp. em especimes biologicos.

• Processo: 07/04728-8
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2007
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2007
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunoquímica
• Pesquisador responsável: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro
• Beneficiário: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro
• Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Assunto(s): Anticorpos monoclonais Candidíase Candida albicans
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: anticorpos monoclonais | Cândida Albicans | Candidíase | imunoensaios | proteinase ácida | Anticorpos monoclonais

Resumo

Proteinases ácidas secretadas (SAP) constituem um importante grupo de fatores de virulência de C. albicans. No presente trabalho, uma proteinase ácida de C. albicans foi seqüencialmente purificada do sobrenadante de cultura da levedura por precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão molecular, liberando uma atividade enzimática específica de 204,1 UI/mg sobre BSA. A massa molecular da proteinase purificada foi estimada em 43 kDa após cromatografia de exclusão e de 41 kDA por SDS-PAGE, em condições não-denaturantes. A proteinase purificada foi capaz de degradar o BSA em pH 2,5, mas não foi ativa sobre o colágeno, e foi significativamente inibida pela pepstatina A. A imunização de camundongos BALB/c com a proteinase purificada e a posterior fusão de seus esplenócitos com células de mieloma resultou em dezenove hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (MAbs), capzes de detectar SAP em ensaios de ELISA. Todos os MAbs obtidos eram imunoglogulinas do isotipo IgG1 kappa (k) e desenvolviam uma banda proteíca de 41kDa por Western blot (WB) em amostras de SAP obtidas dos extratos brutos de C.albicans (12-A) e C.dubliniensis (linhagem 778). Os anti-SAP MAbs foram empregados em ELISA de captura e duas combinações desses anticorpos se mostraram adequadas para a detecção de SAP, isto é, MAP1 (1B1B3) ou MPA2 (2D2C10) como anticorpos de cobertura e MAP3 (2A6E8) biotinilado como anticorpo de detecção. ELISA de captura com este conjunto de anticorpos detectou até 32 ng/mL de proteína nas amostras de SAP purificadas, bem como nos extratos brutos de C.albicans and C.dubliniensis. Os resultados obtidos aqui permitem prever que este grupo de anticorpos monoclonais pode ser útil na detecção de SAP em espécimes biológicos. (AU)