Incorporação sítio específica de aminoácidos não naturais para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas

• Processo: 11/51718-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2012
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2014
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira
• Beneficiário: Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Conformação proteica Aminoácidos Mutagênese sítio-dirigida
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Aminoacidos Nao Naturais | Mutacao Sitio Dirigida | Timet Oligopeptidase

Resumo

O principal objetivo do presente projeto é o estudo das alterações conformacionais que a peptidase timet oligopeptidase (TOP, EC 3.4.24.15) pode sofrer devido à interação com substratos ou inibidores. Essa oligopeptidase tem um canal em sua estrutura, onde se localiza o centro ativo, que pode se fechar ao redor do substrato durante a catalise. TOP mutantes serão preparadas com a introdução por mutação sítio dirigida de um par de sondas, ficando uma de cada lado do canal central presente na estrutura da TOP. Tais sondas poderão ser: resíduos de triptofano (doadores de fluorescência) ou resíduos de aminoácidos não naturais (doadores ou aceptores de fluorescência), e o desenvolvimento da metodologia para a introdução de tais resíduos de aminoácidos não naturais em posições específicas nessas proteínas, é na verdade, por si um dos grandes objetivos do presente projeto. Subseqüentes experimentos de fluorescência no estado estacionário e fluorescência resolvida no tempo serão então realizados na presença de diferentes substratos e inibidores desta peptidase, para se analisar o movimento de "fechamento" do canal ao redor do ligante no centro ativo, que possivelmente pode ocorrer aproximando desta forma as sondas, doador-doador e/ou doador-aceptor. E também a cinética dessas alterações conformacionais será estudada por técnicas de "stopped-flow". (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

MACHADO, MAURICIO F. M.; MARCONDES, MARCELO F.; JULIANO, MARIA A.; MCLUSKEY, KAREN; MOTTRAM, JEREMY C.; MOSS, CATHERINE X.; JULIANO, LUIZ; OLIVEIRA, VITOR. Substrate specificity and the effect of calcium on Trypanosomabrucei metacaspase 2. FEBS Journal, v. 280, n. 11, p. 2608-2621, JUN 2013. (11/51718-3, 08/57336-2)

MARCONDES, M. F. M.; ALVES, F. M.; ASSIS, D. M.; HIRATA, I. Y.; JULIANO, L.; OLIVEIRA, V.; JULIANO, M. A.. Substrate specificity of mitochondrial intermediate peptidase analysed by a support-bound peptide library. FEBS OPEN BIO, v. 5, p. 429-436, 2015. (12/50191-4, 11/51718-3, 11/20941-9, 14/00661-0)