Incorporação sítio específica de aminoácidos não naturais para o estudo de mudanças conformacionais em proteínas

Resumo

O principal objetivo do presente projeto é o estudo das alterações conformacionais que a peptidase timet oligopeptidase (TOP, EC 3.4.24.15) pode sofrer devido à interação com substratos ou inibidores. Essa oligopeptidase tem um canal em sua estrutura, onde se localiza o centro ativo, que pode se fechar ao redor do substrato durante a catalise. TOP mutantes serão preparadas com a introdução por mutação sítio dirigida de um par de sondas, ficando uma de cada lado do canal central presente na estrutura da TOP. Tais sondas poderão ser: resíduos de triptofano (doadores de fluorescência) ou resíduos de aminoácidos não naturais (doadores ou aceptores de fluorescência), e o desenvolvimento da metodologia para a introdução de tais resíduos de aminoácidos não naturais em posições específicas nessas proteínas, é na verdade, por si um dos grandes objetivos do presente projeto. Subseqüentes experimentos de fluorescência no estado estacionário e fluorescência resolvida no tempo serão então realizados na presença de diferentes substratos e inibidores desta peptidase, para se analisar o movimento de "fechamento" do canal ao redor do ligante no centro ativo, que possivelmente pode ocorrer aproximando desta forma as sondas, doador-doador e/ou doador-aceptor. E também a cinética dessas alterações conformacionais será estudada por técnicas de "stopped-flow". (AU)